蔓菁對(duì)小鼠腸道菌群的影響

王文寧,張曉峰,韓 萍,*,于 斐,曹 陽(yáng)

(1.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,河南鄭州 450001;2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生化學(xué)教研室,河南鄭州 450001)

蔓菁(BrassicarapaL.),又名蕪菁,屬十字花科蕓薹屬蕓薹種蕪菁亞種,為兩年生草本植物。蔓菁適應(yīng)性強(qiáng),易于栽培,從東漢時(shí)期便在我國(guó)普遍種植[1],目前產(chǎn)地遍及西藏、新疆、晉南等地。蔓菁是我國(guó)常見(jiàn)的食用蔬菜之一,其肉質(zhì)根既可食用[2],又可藥用,有藏族、維吾爾族、普米族藥用歷史[3]。

研究表明,蔓菁富含多糖、氨基酸、纖維素、黃酮等成分[1],其提取物具有多種生物學(xué)活性。王宇等[4]、楊永東[5]證實(shí)蔓菁多糖可減少血清和腦組織中丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶的活性,具有抗缺氧活性。楊永東等[6]、馬合木提等[7]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蔓菁子多糖可清除自由基達(dá)到抗氧化能力。安熙強(qiáng)等[8]發(fā)現(xiàn)蔓菁粉和蔓菁膏對(duì)小鼠輻射后損傷具有一定的防護(hù)、修復(fù)能力。陳湘宏等[9]發(fā)現(xiàn)蔓菁揮發(fā)油可顯著降低高脂高糖小鼠血糖。此外蔓菁提取物還具有提高免疫力[10]、抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]等活性。目前對(duì)于蔓菁對(duì)腸道功能及代謝的影響少有文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究采用蔓菁粉飼喂小鼠,檢測(cè)小鼠糞樣中腸道菌群數(shù)量和短鏈脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)的含量,探討蔓菁對(duì)腸道菌群的影響,為調(diào)節(jié)腸道功能新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓菁樣品 新鄉(xiāng)市鳳泉區(qū),經(jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院的潘成學(xué)副教授鑒定為蔓菁?jí)K根;SPF級(jí)近交系BalB/C雄性小鼠 48只,6～8 周,體重(20±2) g,河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(豫)2015-0004);基礎(chǔ)飼料 河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(豫)2015-0005);LBS瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基、VRBDA培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基、TSC瓊脂培養(yǎng)基、卵黃乳液 BR級(jí),青島海博生物技術(shù)有限公司;D-環(huán)絲氨酸、L-半胱氨酸 BR級(jí),上海源葉生物科技有限公司。

觀察室 室溫18～22 ℃,相對(duì)濕度45%～55%,通風(fēng)條件良好,環(huán)境相對(duì)安靜,鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室(許可證號(hào):SCXK(豫)2012-0007);DG250型厭氧工作站 英國(guó)DWS公司;PNP9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;7890B-5977A型氣質(zhì)聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司;SW-CJ型超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;HVE-50型高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 參照王宇等[5]的實(shí)驗(yàn)方法并稍作改進(jìn)。將實(shí)驗(yàn)小鼠按體重隨機(jī)分為4 組,即對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組12只,對(duì)照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料,低、中、高劑量組分別飼喂不同劑量蔓菁粉(1、2、4 g/kg·BW·d),連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.2 復(fù)合飼料配制及干預(yù)方法 蔓菁?jí)K根洗凈,去皮,切成1 mm薄片,50 ℃干燥12 h,粉碎,過(guò)60 目篩,放于干燥器備用。將蔓菁粉與基礎(chǔ)飼料以1∶2的比例混合,加適量去離子水,后壓縮成棒狀,制成復(fù)合飼料。干預(yù)組每日同一時(shí)間先給予復(fù)合飼料,吃完后再根據(jù)小鼠食量添加基礎(chǔ)飼料。每周稱(chēng)量一次小鼠體重,根據(jù)體重調(diào)整干預(yù)劑量。

1.2.3 糞樣采集 分別在干預(yù)第0 d(飼喂前)、第7、14 d稱(chēng)重并無(wú)菌收集約0.03 g新鮮糞樣于10 mL滅菌離心管中,加入5 mL滅菌稀釋液,振蕩混勻,制成樣本均質(zhì)液,待測(cè)。

1.2.4 腸道菌群計(jì)數(shù) 參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[12]。

1.2.4.1 滅菌稀釋液和培養(yǎng)基的配制 滅菌稀釋液:吐溫80 1 mL和酵母粉0.5 g溶解在1000 mL去離子水中,調(diào)節(jié)pH7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌20 min,冷卻到50 ℃左右,無(wú)菌加入經(jīng)濾膜除菌的0.5% L-半胱氨酸;LBS瓊脂培養(yǎng)基:取培養(yǎng)基84 g,加吐溫80 1 mL,冰乙酸1.3 mL,溶解在1000 mL去離子水中,調(diào)整pH6.0～6.5,118 ℃高壓滅菌15 min;BBL瓊脂培養(yǎng)基:取培養(yǎng)基70 g,加吐溫80 1 mL,溶解在1000 mL去離子水中,調(diào)整pH7.0,115 ℃高壓滅菌20 min;VRBDA培養(yǎng)基:取培養(yǎng)基39.5 g,溶解在1000 mL去離子水中,調(diào)整pH7.1,121 ℃高壓滅菌15 min;腸球菌瓊脂培養(yǎng)基:取培養(yǎng)基56.25 g,溶解在1000 mL去離子水中,調(diào)整pH8.0,121 ℃高壓滅菌15 min;TSC瓊脂培養(yǎng)基:取培養(yǎng)基47 g,溶解在1000 mL去離子水中,調(diào)整pH7.0～7.2,115 ℃高壓滅菌20 min,冷卻到50 ℃左右,無(wú)菌加入經(jīng)濾膜除菌的0.5% D-環(huán)絲氨酸20 mL和50%卵黃溶液20 mL。

1.2.4.2 平板計(jì)數(shù)方法 采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)腸道菌群。10 倍梯度稀釋樣本均質(zhì)液,接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上,雙歧桿菌采用BBL瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)氣莢膜梭菌采用TSC瓊脂培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng),乳酸桿菌采用LBS瓊脂培養(yǎng)基、腸桿菌采用VRBDA培養(yǎng)基、腸球菌采用腸球菌瓊脂培養(yǎng)基正常培養(yǎng),分別計(jì)數(shù)5種菌。

1.2.5 SCFAs含量的測(cè)定 取糞樣均質(zhì)液2 mL于5 mL離心管中,4000 r/min離心10 min后,取上清1 mL于1.5 mL離心管中,加入0.75 mol/L鹽酸5 μL,振蕩混勻,靜置10 min,13000 r/min離心5 min,取上清1 mL過(guò)0.45 μm濾膜于進(jìn)樣瓶中。樣品保存在4 ℃冰箱中(不超過(guò)3 d),待測(cè)。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)糞樣中乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸的含量。色譜條件為:色譜柱:Agilent DB-WAX石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升溫程序:柱溫的起始溫度為40 ℃,維持1 min,以40 ℃/min的速度將溫度上升到60 ℃,再以10 ℃/min的速度將溫度上升到80 ℃,接著以10 ℃/min的速度將溫度上升到110 ℃,最后以40 ℃/min的速度將溫度上升到190 ℃,維持2 min;以氦氣為載氣,氣流流速為1 mL/min,不分流;進(jìn)樣體積為0.5 μL,進(jìn)樣口溫度為200 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蔓菁對(duì)小鼠體重的影響

不同劑量組小鼠體重隨時(shí)間變化如表1所示。

表1 不同劑量組不同時(shí)間小鼠體重的變化(g,n=12)Table 1 Body weight of mice in different dose groups at different times

由表1可知,在干預(yù)第0、7、14 d,不同組組間小鼠體重變化差異不顯著,即攝入蔓菁對(duì)小鼠體重?zé)o不良影響。

2.2 蔓菁對(duì)小鼠腸道菌群數(shù)量的影響

2.2.1 蔓菁對(duì)小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的影響 不同劑量組不同時(shí)間小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量如表2所示。

由表2可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,中劑量組小鼠糞樣中乳酸桿菌數(shù)量顯著增加(p<0.05),中、高劑量組小鼠糞樣中雙歧桿菌數(shù)量顯著增加(p<0.05),表明相對(duì)于乳酸桿菌,蔓菁對(duì)小鼠糞樣中雙歧桿菌數(shù)量影響較為明顯;飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均顯著增加(p<0.01),表明蔓菁可促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖。相同時(shí)間內(nèi),單一菌種不同劑量組比較,高劑量組乳酸桿菌數(shù)量增加最為明顯,中劑量組雙歧桿菌數(shù)量增加最為明顯,推測(cè)乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖與蔓菁的攝入量有關(guān),可能存在一個(gè)最適范圍。單一菌種同劑量組不同時(shí)間比較,第14 d細(xì)菌數(shù)量增加最為明顯(p<0.01),表明蔓菁發(fā)揮效應(yīng)需要一定時(shí)間累積。

表2 不同劑量組小鼠糞樣中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量(lg CFU/g,n=12)Table 2 The numbers of Lactobacillus and Bifidobacterium in the fecal samples of mice in different dose groups

2.2.2 蔓菁對(duì)小鼠糞樣中腸桿菌和腸球菌數(shù)量的影響 不同劑量組不同時(shí)間小鼠糞樣中腸桿菌和腸球菌的數(shù)量如表3所示。

表3 不同劑量組小鼠糞樣中腸桿菌和腸球菌的數(shù)量(lg CFU/g,n=12)Table 3 The numbers of Enterobacteriaceae and Enterococcus in the fecal samples of mice in different dose groups

由表3可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組小鼠糞樣中腸桿菌數(shù)量均無(wú)明顯變化(p>0.05),腸球菌數(shù)量均明顯減少,且中劑量組腸球菌數(shù)量減少最明顯,表明相對(duì)于腸桿菌,蔓菁對(duì)腸球菌的影響較為明顯;飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中腸桿菌數(shù)量均增加(p<0.05),腸球菌數(shù)量均明顯減少(p<0.05)。相同時(shí)間內(nèi),單一菌種不同劑量組比較,中劑量組腸桿菌和腸球菌變化最明顯(p<0.05),表明蔓菁可促進(jìn)腸桿菌的增殖,抑制腸球菌的增殖,且蔓菁粉劑量為2 g/kg·BW·d時(shí),作用效果最佳。

2.2.3 蔓菁對(duì)小鼠糞樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的影響 不同劑量組不同時(shí)間小鼠糞樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量如表4所示。

表4 不同劑量組小鼠糞樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量(lg CFU/g,n=12)Table 4 The number of Clostridium perfringens in the fecal samples of mice in different dose groups

由表4可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組小鼠糞樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量無(wú)明顯變化(p>0.05);飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均明顯減少(p<0.05),表明蔓菁可有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖,且發(fā)揮效應(yīng)需要一定時(shí)間累積。與對(duì)照組相比,飼喂第14 d,各劑量組小鼠糞樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均明顯減少(p<0.05),且中劑量組減少最為明顯(p<0.05),表明蔓菁粉劑量為2 g/kg·BW·d時(shí),作用效果最佳。

2.3 蔓菁對(duì)小鼠糞樣中SCFAs含量的影響

2.3.1 蔓菁對(duì)小鼠糞樣中乙酸、丙酸含量的影響 不同劑量組不同時(shí)間小鼠糞樣中乙酸、丙酸的含量如表5所示。

表5 不同劑量組小鼠糞樣中乙酸、丙酸的含量(mmol/100 g,n=12)Table 5 The composition of acetic acid,propionic acid in the fecal samples of mice in different dose groups

由表5可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組乙酸、丙酸含量明顯增加(p<0.05);與對(duì)照組相比,在第7 d時(shí),中、高劑量組乙酸含量明顯增加(p<0.05),低劑量組乙酸含量無(wú)明顯變化(p>0.05),各劑量組丙酸含量無(wú)明顯變化(p>0.05),表明相對(duì)于丙酸,乙酸更易受蔓菁干預(yù)影響。飼喂第14 d,各劑量組乙酸、丙酸含量均明顯增加(p<0.05),單一酸不同劑量組比較,高劑量組增加最明顯。由此表明,蔓菁可促進(jìn)乙酸和丙酸的生成,乙酸含量明顯高于丙酸含量,且在蔓菁粉劑量為4 g/kg·BW·d時(shí),作用效果最佳。

2.3.2 蔓菁對(duì)小鼠糞樣中正丁酸、異丁酸含量的影響 不同劑量組不同時(shí)間小鼠糞樣中正丁酸、異丁酸的含量如表6所示。

表6 不同劑量組小鼠糞樣中正丁酸、異丁酸的含量(mmol/100 g,n=12)Table 6 The composition of n-butyric acid,isobutyric acid in the fecal samples of mice in different dose groups

由表6可知,與第0 d相比,飼喂第7 d,各劑量組正丁酸的含量均明顯增加(p<0.05),各劑量組異丁酸含量無(wú)明顯變化(p>0.05),表明相對(duì)于異丁酸,正丁酸更易受蔓菁干預(yù)影響;與對(duì)照組相比,飼喂第7 d時(shí),低、高劑量組正丁酸含量明顯增加(p<0.05),中劑量組正丁酸含量無(wú)明顯變化(p>0.05),高劑量組異丁酸含量明顯增加(p<0.05),低、中劑量組異丁酸含量無(wú)明顯變化(p>0.05),表明正丁酸、異丁酸的產(chǎn)生受蔓菁干預(yù)劑量的影響。飼喂第14 d,各劑量組正丁酸、異丁酸含量均明顯增加(p<0.05),且高劑量組增加最明顯,表明蔓菁可促進(jìn)丁酸的生成,且在蔓菁粉劑量為4 g/kg·BW·d時(shí),作用效果最佳。單一酸同劑量組不同時(shí)間比較,第14 d丁酸含量增加最為明顯(p<0.05),表明蔓菁發(fā)揮效應(yīng)需要一定時(shí)間累積。

3 討論

作為維持腸道穩(wěn)定的重要因素,腸道菌群與機(jī)體健康之間的關(guān)系越來(lái)越得到人們的重視[13]。研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群的失調(diào)與肥胖、肝臟疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等疾病密切相關(guān)[14-16],而腸道益生菌雙歧桿菌、乳酸桿菌的補(bǔ)充可緩解腸道紊亂[17-18],相對(duì)于藥物或生物制劑調(diào)節(jié)腸道菌群,飲食結(jié)構(gòu)的改變和膳食營(yíng)養(yǎng)成為人們關(guān)注的熱門(mén)[19]。本研究在小鼠日常飲食中添加1、2、4 g/kg·BW·d劑量的蔓菁粉,干預(yù)后發(fā)現(xiàn),小鼠糞便中的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加(p<0.05),腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)目明顯減少(p<0.05),與徐梓荷[20]研究瑪咖對(duì)腸道菌菌群的影響結(jié)果一致,滿(mǎn)足《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中調(diào)節(jié)腸道菌群的要求[12]。蔓菁對(duì)腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用可能與腸道內(nèi)益生菌的增殖有關(guān),Alimolaei等[21]研究發(fā)現(xiàn),腸道內(nèi)某些益生菌或益生菌菌制劑可有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的增長(zhǎng),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

短鏈脂肪酸主要由結(jié)腸厭氧菌發(fā)酵未被消化的碳水化合物形成的,主要包括乙酸、丙酸、丁酸[22-23],具有促進(jìn)能量代謝,減輕肥胖[24]、消除炎癥[25]、改善腸道功能、提高免疫力[26]等功能,短鏈脂肪酸含量的增加對(duì)機(jī)體健康具有重要促進(jìn)作用,所以本研究探討了蔓菁對(duì)小鼠腸道內(nèi)短鏈脂肪酸含量的影響。通過(guò)蔓菁粉飼喂小鼠發(fā)現(xiàn),干預(yù)后小鼠糞樣中乙酸、丙酸、丁酸含量均顯著增加(p<0.05),推測(cè)可能與蔓菁促進(jìn)腸道益生菌增殖,抑制腸道有害菌的增殖及腸道環(huán)境的改變有關(guān),這與徐梓荷[20]研究瑪咖對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié),進(jìn)而對(duì)短鏈脂肪酸含量產(chǎn)生的影響結(jié)果一致,具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。所以日常飲食中添加蔓菁可以有效促進(jìn)腸道短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,降低腸道pH,維持機(jī)體健康。

4 結(jié)論

蔓菁可促進(jìn)腸道益生菌乳酸桿菌、雙歧桿菌和中性菌腸桿菌的增殖,中劑量(2 g/kg·BW·d)作用最為明顯,且腸桿菌數(shù)量增加幅度低于乳酸桿菌和雙歧桿菌增加幅度,并抑制中性菌腸球菌和致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖。蔓菁還可促進(jìn)腸道內(nèi)乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸的產(chǎn)生,提高短鏈脂肪酸總含量,且高劑量(4 g/kg·BW·d)作用最為明顯。