中國野生藍(lán)莓總花青素對氯化鎘誘導(dǎo)的慢性肝損傷的保護(hù)作用

岳 恒,許倩倩,景志行,蘇攀峰,許劍鋒,*,于曉巍

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院海洋生物制藥教研室,上海 201306;2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海),上海 201306;3.上海交通大學(xué)附屬上海市第六人民醫(yī)院東院骨科,上海 201306)

肝臟是腹腔內(nèi)最大的實質(zhì)性器官,擔(dān)負(fù)人體的重要生理功能。作為消化器官,肝臟對糖類、蛋白質(zhì)、脂肪三大營養(yǎng)物質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)化和代謝具有重要作用,保障生命體的生存和發(fā)展。目前肝臟疾病成為威脅人類健康的常見疾病之一[1]。隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展和經(jīng)濟(jì)增長,有毒化學(xué)物質(zhì),包括重金屬和殺蟲劑廣泛應(yīng)用于發(fā)展中國家,環(huán)境中的重金屬越來越多,對人類的健康和安全造成了極大的影響[2-3]。重金屬鎘可經(jīng)消化道或呼吸道進(jìn)入人體,對骨骼、腎、肝臟、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均可造成損傷,且在人體內(nèi)的生物半衰期長達(dá)10～30年,可引起慢性毒作用[4]。研究[5-7]表明,慢性病(糖尿病、高血壓、代謝綜合癥、癌癥等)與體內(nèi)的氧化應(yīng)激平衡密切相關(guān),而攝入一些抗氧化成分則有利于改善體內(nèi)的氧化還原平衡。藍(lán)莓總花青素(blueberry anthocyanins,BA)是藍(lán)莓果實中天然含有的物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[8],但國內(nèi)外對于藍(lán)莓總花青素的保肝、護(hù)肝效果的研究鮮有報道,可能與中國野生藍(lán)莓口感稍差有關(guān)[9]。

利用傳統(tǒng)解毒劑驅(qū)排體內(nèi)蓄積的鎘雖能起到一定的解毒作用,但是對機體本身的副作用較大[10-11]。為了開發(fā)天然高效的解毒劑,本研究以CdCl2灌胃小鼠建立慢性肝損傷動物模型,肝臟Cd2+含量、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)含量、還原型谷胱甘肽(GSH)含量以及血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量為指標(biāo),研究中國野生藍(lán)莓總花青素對慢性肝損傷的輔助治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國野生藍(lán)莓 采摘于中國大興安嶺林區(qū);昆明種小鼠(SPF級,雄性) 50只,體重(18±2)g,許可證號:SCXK(滬)2012-0002,上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司;XAD-7HP大孔樹脂 美國Sigma公司;總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;氯化鎘(CdCl2) 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

SB25-12D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;WFX-10型原子吸收分光光度計 北京第二光學(xué)儀器廠;6400型火焰光度計 上海分析儀器廠;UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津;CR-21G型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司;AEROSET全自動生化分析儀 美國雅培制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中國野生藍(lán)莓總花青素的提取 純化總花青素由本實驗室改進(jìn)Prior RL等[12]的方法自行提取,藍(lán)莓凍果粉碎后冷凍干燥成粉末狀,過60目篩,取200 g粉末,與甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.5(體積比)的3000 mL混合溶液混勻,攪拌30 s,超聲功率500 W下,于40 ℃超聲5 min,在此過程中充分搖勻2次,使樣品重新混勻,靜置5 min后,攪拌30 s,靜置5 min。離心10 min(6000 r/min,4 ℃),收集上清液。殘渣中加入2000 mL甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.5的混合溶液按上述方法繼續(xù)提取,重復(fù)提取5次左右,直至殘渣中顏色不再變化,合并所有上清液,離心10 min(8000 r/min,4 ℃),取上清液,40 ℃減壓蒸發(fā)除去甲醇,置于-20 ℃冰箱保存。將上述所得的提取液裝入XAD-7HP大孔樹脂柱中純化,體積比為1∶3。大孔樹脂采用濕法裝柱,先用 95% 乙醇洗脫 2～3 個BV,其次用蒸餾水洗至無醇味,最后用2～3倍體積 0.5%甲酸水溶液飽和吸附柱,上樣2 mL,充分吸附后開始洗脫,流速0.5 mL/min,先用超純水洗脫,去除多糖、蛋白等雜質(zhì),再用0.5%甲酸酸化的甲醇洗脫5 BV,回收洗脫得到的總花青素,40 ℃減壓蒸餾去除酸化甲醇,乙酸乙酯(1∶3=v∶v)室溫下萃取3次,每次30 min,最后減壓濃縮收集得總花青素,置于-20 ℃保存[13]。

1.2.2 中國野生藍(lán)莓總花青素含量的測定 采用pH示差法測定藍(lán)莓總花青素的含量(矢車菊-3-O-葡萄糖苷為對照),各取1 mL樣品分別加入4 mL pH4.5的醋酸鈉緩沖液(0.4 mol/L)和0.025 mol/L氯化鉀緩沖溶液(pH1.0),充分振蕩均勻,分別在波長520和700 nm下測定吸光值。重復(fù)3次,結(jié)果按照以下公式計算。

式中:C-中國野生藍(lán)莓中總花青素的含量,mg/100 g;A=(OD520-OD700)pH1.0-(OD520-OD700)pH4.5;ε-摩爾吸光系數(shù),按照矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾系數(shù)進(jìn)行計算,是26900;MW-矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量,是449.2 g/mol;DF稀釋因子;1比色皿寬度(1 cm)。最后結(jié)果用100 g樣品中含有總花青素的量(mg)來表示。

1.2.3 動物分組與處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,按體重均衡原則隨機分為5組,每組10只,分別為空白對照組(灌胃0.3 mL生理鹽水)、鎘損傷組(灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2+生理鹽水共0.3 mL)、藍(lán)莓總花青素低劑量組(BAL)、中劑量組(BAM)和高劑量組(BAH)(灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2,同時分別灌胃10.0、20.0、40.0 mg/kg/d的藍(lán)莓總花青素共0.3 mL)。每10 d固定時間對小鼠進(jìn)行稱重,并按體重量進(jìn)行精確喂飼,連續(xù)飼養(yǎng)90 d,實驗結(jié)束前24 h,所有小鼠禁食不禁水。

1.2.4 小鼠生活狀態(tài)觀察 觀察各組小鼠的生長情況,包括小鼠體重、身體外觀、進(jìn)食量多少、排泄物量以及反應(yīng)靈敏性等,并及時做好相關(guān)記錄。

1.2.5 小鼠肝臟系數(shù)的測定 解剖小鼠并取出肝臟,置于預(yù)冷過的生理鹽水中去除表面結(jié)締組織,經(jīng)預(yù)冷過的生理鹽水漂洗3～4次后,用濾紙吸干表面水分并稱重,最后根據(jù)公式計算肝臟系數(shù):

1.2.6 肝臟組織中Cd2+含量測定

1.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱量CdCl2,用3 mol/L的硝酸完全溶解,配制含Cd2+為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)液備用。使用時逐級稀釋為50、10、5、1、0.5、0.1、0.01 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液液,4 ℃冷藏保存。開始測量時,按Cd2+濃度從小到大依次進(jìn)樣,對不同濃度Cd2+溶液的吸光值進(jìn)行檢測,最后記錄吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.2 Cd2+含量的測定 5組小鼠肝組織樣本,分別稱取相同質(zhì)量,置于坩堝內(nèi)并標(biāo)號,安置于馬弗爐中,500 ℃中灰化6 h;待自然冷卻后,用8 mL 3 mol/L的硝酸溶解殘留物直至完全溶解,過濾不溶物,于恒定4 ℃條件下保存。按照標(biāo)準(zhǔn)液中Cd2+濃度從小到大的順序進(jìn)樣,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1。當(dāng)R2>0.99 時,開始進(jìn)行樣品測量,并記錄吸光度值,每個樣品測定三次,并對不同組小鼠肝臟Cd2+含量進(jìn)行計算統(tǒng)計。

1.2.7 血清生化指標(biāo)的檢測 眼眶取血約1 mL,置 EP 管中靜置 15 min,然后 4 ℃、3500 r/min 離心10 min,分離血清,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用全自動生化分析儀檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性。

1.2.8 肝組織勻漿液中氧化損傷指標(biāo)的測定 將取完血的小鼠斷頸處死,解剖分離肝臟,精確稱重,液氮冷凍后置 EP 管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩７Q取約0.2 g肝臟,加入9倍體積的生理鹽水充分研磨制成勻漿,于4 ℃、3000 r/min離心10 min,取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒所述步驟檢測樣本中總抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化指標(biāo)GSH、GST及脂質(zhì)過氧化指標(biāo)MDA。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓總花青素含量測定結(jié)果

以波長520 nm為最大吸收波長,并將花青素含量轉(zhuǎn)變成每100 g樣品含的花青素的量(mg)。測得該實驗藍(lán)莓中總花青素含量為(149.66±3.45) mg/100 g凍果。

2.2 小鼠生活狀態(tài)觀察

觀察各實驗組小鼠生長情況,發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠食欲旺盛,生長迅速,排泄物呈黑褐色規(guī)則米粒狀,毛皮光亮、柔順,腿部肌肉有力、富有彈性;眼睛明亮有神,反應(yīng)敏捷;鎘損傷組小鼠嗜睡厭食,生長緩慢,排泄物稀少,呈灰色、灰褐色米?；虿灰?guī)則形狀;毛皮暗啞泛黃;行動緩慢、反應(yīng)遲鈍;藍(lán)莓總花青素3個劑量組,小鼠進(jìn)食正常,排泄良好,毛皮柔順,眼睛靈活有神,反應(yīng)機敏。

研究表明,CdCl2的攝入,對小鼠的食欲、生長、神經(jīng)發(fā)育以及正常的生理活動造成嚴(yán)重影響,而通過飼喂藍(lán)莓花青素,小鼠的生長、生活情況得以明顯改善。

2.3 小鼠生長狀況

由表1可知,鎘損傷組與空白對照組比較,差異極顯著(p<0.01),說明鎘能夠?qū)ιL期小鼠的正常生長造成嚴(yán)重影響;與鎘損傷組相比,BA低、中、高劑量干預(yù)組小鼠每10 d體重增長差異極顯著(p<0.01),表明BA能夠在一定程度上改善鎘對小鼠所造成的生長緩慢,促進(jìn)小鼠進(jìn)食、健康生長。

表1 各組小鼠平均體重增長Table 1 Average body weight of mice in each group

2.4 小鼠肝臟系數(shù)

由表2可以看出,與鎘損傷組比較,空白對照組及BA低、中、高劑量干預(yù)組的肝臟重量及肝臟系數(shù)差異不顯著,3個劑量的BA組未對肝臟產(chǎn)生不良影響。

表2 各組小鼠肝臟濕重及肝臟系數(shù)Table 2 The wet weight of mice liver and liver coefficient in each group

2.5 肝臟組織中Cd2+含量

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 按照標(biāo)準(zhǔn)液中Cd2+濃度從小到大的順序進(jìn)樣,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,其線性回歸方程為y=0.0003x+0.0012,R2=0.99993。

圖1 Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液變化曲線Fig.1 Standard curve of the Cd2+ solution

2.5.2 Cd2+含量 由圖2可知,每天灌胃1.0 mg/kg的CdCl2,90 d后小鼠每單位肝組織中Cd2+含量達(dá)到(26.54±5.43)μg/g,與空白對照組差異極顯著(p<0.01),表示建模成功;與鎘損傷組相比,BA低、中、高劑量干預(yù)組小鼠每單位肝組織中Cd2+含量顯著降低(p<0.05),表明鎘在小鼠肝臟中代謝緩慢,不易排出,產(chǎn)生明顯的蓄積現(xiàn)象,而BA能夠很好的抑制鎘在肝臟處的蓄積,加速鎘排出肝細(xì)胞,從而減少游離Cd2+對機體的損傷。

圖2 不同組小鼠肝臟組織中Cd2+的含量Fig.2 Cd2+content in liver tissue of different groups of mice

2.6 血清生化指標(biāo)

由圖3和圖4可知,與空白對照組相比,鎘損傷組AST、ALT指標(biāo)均有極顯著差異(p<0.01),表明鎘對小鼠的肝臟造成了明顯的損傷。BA低、中、高劑量干預(yù)組AST、ALT指標(biāo)與鎘損傷組差異極顯著(p<0.01),且與濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明BA能夠很好的抑制鎘引起的肝損傷致的AST、ALT升高,且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖3 不同組小鼠AST的活性Fig.3 AST activity of different groups of mice

圖4 不同組小鼠ALT的活性Fig.4 ALT activity of different groups of mice

2.7 肝組織勻漿液氧化損傷測定

從表3可知,與空白對照組相比,鎘損傷組T-AOC、GSH、GST、MDA指標(biāo)均有極顯著差異(p<0.01);與鎘損傷組相比,BA高劑量干預(yù)組(40 mg/kg/d)的T-AOC、GSH、GST、MDA含量差異極顯著(p<0.01),BA中劑量干預(yù)組的T-AOC、GSH、GST含量顯著升高(p<0.05),但MDA含量的變化不顯著。BA低劑量干預(yù)組的T-AOC、GSH含量顯著升高(p<0.05),但GST與MDA含量的變化不顯著。整體來看,隨著BA濃度的升高,T-AOC、GSH、GST含量隨著升高,而MDA含量隨之降低。表明BA能夠在一定程度上抑制鎘損傷致小鼠肝臟組織氧化損傷,且抑制能力與BA的濃度相關(guān)。

表3 氧化損傷指標(biāo)Table 3 Oxidative damage indicators

3 討論與結(jié)論

鎘致肝損傷的機理至今沒有明確的解釋,普遍的認(rèn)為是鎘毒性與氧化損傷密切相關(guān)。例如急性鎘中毒情況下造成的氧化損傷與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的減少有關(guān)[14],也有研究認(rèn)為鎘染毒破壞了機體內(nèi)部各個方面的動態(tài)平衡,進(jìn)而造成對身體嚴(yán)重的影響[15-16]。鎘對機體的氧化損傷有很多種途徑,常規(guī)是兩種,分別是破壞體內(nèi)自由基的平衡和抗氧化系統(tǒng)的功能[17]。

當(dāng)肝實質(zhì)細(xì)胞損傷,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性的改變或破壞,使得肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST,進(jìn)入血液中,因此血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST 水平可以作為反映了肝臟組織細(xì)胞的損傷程度的敏感指標(biāo)[18]。前者活性升高則提示肝細(xì)胞破壞、細(xì)胞膜通透性增強,后者活性增強提示線粒體損傷。兩者極易受到Cd2+的影響,其活性的變化可以反映肝細(xì)胞損害程度。本研究發(fā)現(xiàn),Cd2+的毒性效應(yīng)會顯著增加小鼠血清 AST、ALT 的釋放,對肝臟造成炎癥損傷,而適當(dāng)量的中國野生藍(lán)莓總花青素的干預(yù)能使血清 AST、ALT 釋放減少,減輕氯化鎘誘導(dǎo)的肝損傷的炎癥反應(yīng)。實驗結(jié)果表明,1.0 mg/kg/d CdCl2飼喂小鼠90 d,小鼠日均體重增長極顯著下降(p<0.01),且血清指標(biāo)AST、ALT極顯著升高(p<0.01),提示本實驗小鼠慢性肝損傷模型建立成功,與前人報道用CdCl2建立慢性肝損傷模型[19]相比,本實驗的染鎘周期增加到了90 d,大大增加了慢性肝損傷建模的周期,進(jìn)一步研究了小鼠體重增長、肝臟組織中Cd2+的含量、血液、肝臟各項指標(biāo)在這個周期中的變化。且本實驗鎘損傷組MDA含量極顯著高于空白對照組(p<0.01),說明連續(xù)90 d灌胃1.0 mg/kg/d的CdCl2可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷明顯增強,與以往的報道一致[20]。

在肝損傷的防治方面,與自由基密切相關(guān)的物質(zhì)以及外源性抗氧化劑起著重要的作用[21-22]。機體內(nèi)過量游離自由基會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂肪和核酸的氧化損傷,心臟病、關(guān)節(jié)炎、老年癡呆、癌癥等都與體內(nèi)氧化與抗氧化體系失衡有一定關(guān)系[23]。人體內(nèi)存在天然的抗氧化系統(tǒng),而外源的重金屬離子會破壞機體的氧化系統(tǒng)的平衡,從而導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激損傷[23]。大量研究表明,鎘通過影響肝臟細(xì)胞中相關(guān)抗氧化酶的活性,從而影響肝臟細(xì)胞中自由基的清除,肝臟細(xì)胞中游離的自由基作用于多不飽和脂肪酸生成MDA,加重脂質(zhì)過氧化損傷,從而造成小鼠的肝臟損傷[25-27]。Cd2+體內(nèi)的長期累積會導(dǎo)致機體氧化、抗氧化系統(tǒng)失衡,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA增多,MDA是脂質(zhì)過氧化損傷的主要降解產(chǎn)物,因此測定MDA這個指標(biāo)能夠反映小鼠肝臟細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的情況,而 T-AOC、GSH和 GST 作為抗氧化酶系統(tǒng)中的重要組成部分,能有效反映體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的狀態(tài)。本文中BA各劑量干預(yù)組MDA指標(biāo)均與鎘損傷存在差異,且與濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明藍(lán)莓花青素對小鼠肝臟氧化損傷有一定的保護(hù)作用,本結(jié)果與鄒志輝等[20]報道的葡萄籽原花青素對鎘致肝損傷保護(hù)作用的研究結(jié)果一致。藍(lán)莓總花青素可能通過大量清除肝臟細(xì)胞中自由基,從而改善肝臟細(xì)胞過氧化損傷,增強肝臟細(xì)胞中相應(yīng)抗氧化酶的活性,從而提高肝臟細(xì)胞抗氧化能力,達(dá)到有效的保肝效果,但還需進(jìn)一步深入研究證實。

本研究填補了中國野生藍(lán)莓總花青素在治療重金屬致慢性肝損傷方面研究的空白,為其開發(fā)成新型天然的解毒劑提供了重要依據(jù),但是目前國內(nèi)對中國野生藍(lán)莓總花青素保肝效果的研究報道較少,因此需要對其作用機制展開進(jìn)一步的研究。