n3多不飽和脂肪酸對結腸癌細胞HCT116抗增殖作用

沈 妮,張程程,何成自菁,王姍姍,于海寧,沈生榮,*

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江杭州 310058;2.浙江工業(yè)大學藥學院,浙江杭州 310014)

n-3多不飽和脂肪酸在生物體內的轉化中,α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA,18∶3)經Δ6和Δ5脫氫酶以及鏈延長酶轉化成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA,20∶5),EPA代謝形成前列腺素3系,血栓素3系和白三烯5系的前體,EPA進一步經鏈延長酶催化作用轉化為二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA,22∶5),DPA經鏈延長酶、Δ6脫氫酶和β-氧化作用轉化為二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA,22∶6)[1-4]。多不飽和脂肪酸除經去飽和及鏈延長作用在體內相互轉化外,還可作為底物經環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)、脂氧合酶(lipoxygenases,5-,12-,15-LOX)等酶代謝轉化為更復雜的產物[5]。DHA和EPA不僅可以生成前列腺素(prostaglandins,PGs)、血栓素(thromboxanes,TXs)和白三烯(leukotrienes,LTs)的各類前體,還可形成脂氧素(LXs)、消散素(resolvins)、保護素(protectins)和巨噬細胞源消散素(maresins)的前體[6],這些代謝產物在炎癥和腫瘤過程中有著重要作用?？偟膩碚f,PGs,TXs和LTs具有促炎活性和免疫抑制作用,促進腫瘤細胞增殖,而LXs,消散素(RSVs)和保護素具有抗炎作用,脂肪酸的這兩類代謝產物在生物體內的平衡將最終影響炎癥和癌癥的發(fā)展程度[5,7]。

部分研究認為多不飽和脂肪酸的細胞毒性作用可歸功于其代謝提高了體內PGs,TXs和LTs水平,然而這一觀點目前仍存在較大爭議[8-9]。本實驗以結腸癌細胞HCT116為研究對象,分析n-3系PUFAs(ALA,EPA,DHA)在癌細胞內的代謝轉化及代謝產物的表達變化,進一步探究n-3脂肪酸對結腸癌細胞毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

結腸癌細胞株HCT116 中國科學院細胞庫;RPMI 1640 培養(yǎng)基 美國Gibco公司;新生牛血清 杭州四季青;胰蛋白酶(≥2500 units/mg) 上海生物工程有限公司;LTB4、PGE2、LXA4標準品Cayman;ALA、EPA、DHA、5-氟尿嘧啶、MTT、油紅O染料 Sigma;Annexin V-FITC試劑盒 碧云天生物技術研究所;LTB4、PGE2、LXA4、COX-2 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 上海西唐生物科技;Bardford蛋白檢測試劑 上海貝博試劑公司;其余試劑 均為色譜純或分析純。

MD29SpectraMax酶標儀 芬蘭Thermal Lab System公司;FC500MCL流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司;倒置顯微鏡 日本Nikon;7890A氣相色譜分析儀 安捷倫科技(中國)有限公司;DB-23(0.25 mm×60 m×0.25μm)色譜柱 安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 結腸癌細胞株HCT116培養(yǎng)于含10%低毒無支原體新生牛血清的pH為6.5的1640培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)液中還應該加有100 UI/mL的青霉素和鏈霉素,以防培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的污染。細胞置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,每隔3～4 d傳代一次。

1.2.2 MTT法測定細胞存活率 取190 μL對數(shù)生長期細胞懸液接種于96孔板,每孔設置等體積培養(yǎng)液對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,細胞充分貼壁后,分別加入不同濃度的ALA、EPA、DHA和5-FU,對照組加入等體積培養(yǎng)液,繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h。處理時間到,立刻取出96孔板,棄去孔內培養(yǎng)液,每孔加入20 μL MTT,放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。而后取出96孔板,每孔加入150 μL DMSO,置于水平振動器使紫色甲臜晶體充分溶解,用酶標儀讀取490 nm處吸光值。每組處理細胞存活率計算公式如下:

1.2.3 Annexin V-FITC凋亡檢測 取3.8 mL對數(shù)生長期細胞懸液接種于6孔板內,繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞充分貼壁。分別加入多不飽和脂肪酸和5-FU處理液,對照組加入等體積細胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用胰蛋白酶溶液消化細胞,細胞懸液于4 ℃ 1500 r/min條件下離心5 min,棄去液體。底部細胞用預冷的PBS洗滌兩次,再次于4 ℃ 1500 r/min條件下離心5 min,棄去PBS。用400 μL Annexin V結合液懸浮細胞,輕輕吹打均勻后將細胞轉移至流式細胞管中,加入5 μL Annexin V-FITC染液,輕輕混勻后于2～8 ℃下避光染色15 min。而后加入10 μL PI染液,輕輕混勻后于2～8 ℃下避光孵育5 min,于1 h內上流式細胞儀檢測。

1.2.4 油紅染色分析細胞對脂肪酸的吸收量 細胞培養(yǎng)及處理過程同步驟1.2.2,培養(yǎng)結束后,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗2次,用10%的甲醛固定液固定10 min。隨后用PBS洗滌細胞3次,室溫下晾置20 min后用0.5 ml油紅O工作液進行染色。細胞充分浸沒于染液中30 min后棄去油紅O染液,接著用60%異丙醇洗滌細胞2次,超純水洗滌細胞3次。最后將細胞置于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 細胞脂肪酸組成成分分析 細胞培養(yǎng)及處理過程同步驟1.2.2,培養(yǎng)結束后,用胰蛋白酶消化細胞并離心收集,PBS清洗2次后再次于4 ℃ 1500 r/min條件下離心并收集,重懸于0.5 mL超純水中。甲酯化:將細胞轉移到具塞玻璃試管內,快速加入3 mL 5%鹽酸甲醇(w/v),振蕩后放入100 ℃恒溫箱甲酯化反應3 h,冷卻至室溫,加入1 mL超純水和1 mL正己烷強力振蕩1 min后靜置,回收上層正己烷層,水層用2 mL正己烷萃取2次。合并正己烷相并用等體積超純水洗滌一次,收集正己烷相,無水硫酸鈉干燥,過濾后用高純氮氣吹干,100 μL正己烷回溶脂肪酸甲酯,待測。

GC色譜條件:氣相色譜分析儀進行檢測,色譜柱DB-23(0.25 mm×60 m×0.25 μm),載氣高純氮氣流速1.5 mL/min,進樣口溫度250 ℃,FID檢測器溫度250 ℃,程序升溫條件:130 ℃保持1 min,6.5 ℃/min升至170 ℃,接著2.75 ℃/min升至225 ℃并停留10 min。采用脂肪酸甲酯混標進行外標法定量。

1.2.6 ELISA分析LTB4、PGE2、LXA4表達 細胞培養(yǎng)及處理過程同步驟1.2.2,培養(yǎng)結束后,收集細胞培養(yǎng)液并在4 ℃下3000 r/min離心5 min,收集上清液用于LTB4、PGE2、LXA4含量測定。檢測用對應商品化ELISA Kit測定,檢測方法參照試劑盒說明書。另需用胰酶消化收集細胞用于蛋白測定,參照試劑盒說明書進行。LTB4、PGE2、LXA4含量結果需用胰酶進行校正,本文最終結果為各處理組LTB4、PGE2、LXA4含量相對于空白對照組百分比。

1.2.7 LTB4、PGE2、LXA4對癌細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞懸液接種于96孔板,每孔設置等體積培養(yǎng)液對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,細胞充分貼壁后,細胞進行無血清饑餓12 h(即采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞12 h)。加入不同濃度(5、50、500 nmol/L)的脂肪酸代謝產物LTB4、PGE2、LXA4,對照組加入等體積培養(yǎng)液,繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h采用MTT法測定細胞存活率,由此評價脂肪酸代謝產物對結腸癌細胞增殖的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 ALA、EPA、DHA和5-FU對細胞存活率的影響

如圖1所示,不同劑量的n-3多不飽和脂肪酸和5-FU對結腸癌細胞HCT116的生長均有不同程度的抑制,且具有明顯的時間和劑量效應。MTT結果顯示,24 h后低濃度脂肪酸(0～25 μmol/L)幾乎不影響HCT116細胞的正常生長,并且還能輕微地促進其生長。ALA、EPA、DHA和5-FU的濃度為200、160、120、10 μmol/L時,48 h后細胞存活率分別為53.8%、57.3%、58.6%和54.1%。由此可以看出,來源于海洋魚類不飽和程度更高的脂肪酸EPA和DHA較來源于植物油的ALA表現(xiàn)出更強的抗結腸癌活性。

圖1 不同劑量脂肪酸和5-FU對HCT116細胞存活率的影響Fig.1 Effect of ALA,DHA,EPA and 5-FU concentration on HCT116 cell viability

2.2 ALA、EPA、DHA和5-FU對細胞凋亡的影響

利用Annexin V/PI雙染色法可在流式細胞儀區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和死細胞。如圖2所示,結腸癌細胞株HCT116在未經藥物處理時(CK組)表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài),細胞中未見明顯的凋亡和死亡。當DHA、EPA、ALA和5-FU作用48 h后,細胞發(fā)生了一定程度的凋亡,DHA、EPA、ALA和5-FU處理組的凋亡率分別為29.2%、21.8%、7.9%和10.4%,DHA和EPA促結腸癌細胞凋亡的效果優(yōu)于ALA,與MTT結果相符。

圖2 ALA、EPA、DHA和5-FU對HCT116細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of ALA,DHA,EPA and 5-FU on the apoptosis of HCT116 cells 注:ALA、EPA、DHA、5-FU濃度分別為200、160、120、10 μmol/L,圖3同；B1代表死亡細胞；B2代表早期凋亡細胞；B3代表正常細胞；B4代表晚期凋亡細胞。

2.3 ALA、EPA、DHA和5-FU促進結腸癌細胞內脂滴積累

油紅O染色法可觀察HCT116細胞經多不飽和脂肪酸處理后細胞質中脂滴分布情況,結果如圖3所示。從圖3中可以看出,未經藥物處理過的癌細胞幾乎沒有脂滴積累。經5-FU處理后,HCT116細胞出現(xiàn)少數(shù)顆粒較小的脂滴,說明細胞被損傷后有部分脂肪進入胞質。而經ALA、EPA、DHA處理后,癌細胞內脂滴數(shù)量明顯增加、體積明顯增大,說明添加的脂肪酸在細胞質中以脂滴的形式積累。

圖3 HCT116細胞經ALA、EPA、DHA和5-FU處理48 h后細胞內脂滴積累的油紅染色圖(100×)Fig.3 The pictures of oil red straining with the accumulation of lipid droplets in HCT116 cells after the addition of ALA,DHA,EPA and 5-FU for 48 h(100×)

2.4 ALA、EPA、DHA和5-FU對癌細胞內脂肪酸組成的影響

如表1所示,n-3多不飽和脂肪酸處理改變了結腸癌細胞HCT116內的脂肪酸組成比例。很明顯,經ALA、EPA、DHA處理后,HCT116細胞內對應的脂肪酸含量顯著升高(p<0.05)。額外補充ALA(200 μmol/L)、EPA(160 μmol/L)和DHA(120 μmol/L)后,細胞內對應的脂肪酸含量可分別由對照組的0%、0.79%±0.01%、2.40%±0.17%增加到11.75%±1.16%、36.41%±0.38%、39.84%±1.30%。經實驗發(fā)現(xiàn),ALA的添加使得HCT116細胞內大量累積EPA(從0.79%±0.01%上升到4.09%±0.24%)和DHA(從2.40%±0.17%上升到21.57%±1.94%),EPA的添加使得HCT116細胞內大量累積DHA(從2.40%±0.17%上升到19.21%±0.03%),而DHA的添加卻未明顯提高胞內ALA和EPA含量,說明在HCT116細胞內從ALA轉化為EPA再轉化為更長鏈的脂肪酸DHA的轉化效率很高,且不可逆[23]。另一方面,作為母體脂肪酸,ALA還能在HCT116細胞內少量轉化為n-6系脂肪酸亞油酸(從2.43%±0.22%上升到5.14%±0.04%)和花生四烯酸(從2.99%±0.45%上升到4.96%±0.07%),DHA和EPA則無此功能。陽性藥物5-FU的添加對HCT116細胞內脂肪酸組成變化與空白對照組整體上無明顯差異,說明5-FU引起的細胞凋亡未造成細胞內脂肪酸組成變化。

表1 ALA、EPA、DHA和5-FU處理48 h后HCT116細胞內的脂肪酸分析結果Table 1 Fatty acid analysis of HCT116 cells with ALA,DHA,EPA and 5-FU for 48 h

2.5 脂肪酸代謝產物PGE2、LTB4、LXA4含量變化

研究表明LTB4和PGE2具有促炎作用,可促進腫瘤細胞侵襲,提高細胞遷移能力,上調VEGF表達,抑制癌細胞凋亡和免疫功能[8,10]。反之,LXA4是一類抗炎分子,具有與PGE2相反的生物活性,可抑制腫瘤細胞的增殖,侵襲和遷移能力[11]。如圖4A、圖4B所示,ALA、EPA和DHA處理明顯促進HCT116細胞PGE2和LXA4的分泌(p<0.05),而陽性藥物5-FU處理組卻明顯下調LXA4分泌,對PGE2的分泌未造成影響。LXA4/PGE2含量比可在一定程度上反映脂肪酸代謝產物,即促炎因子和抗炎因子在細胞內的平衡更趨向于哪方[5]。如圖4D所示,對于HCT116細胞,所有脂肪酸處理組(5-FU組除外)的LXA4/PGE2的比例較空白對照組顯著上調(p<0.05)。另外,如圖4C所示,HCT116細胞的所有脂肪酸處理組(ALA、EPA、DHA)的LTB4分泌量被明顯下調,僅5-FU處理組的LTB4分泌量較空白對照組有了顯著的提升(p<0.05)。

圖4 ALA、EPA、DHA和5-FU處理對HCT116細胞PGE2、LTB4、LXA4、LXA4/PGE2含量變化的影響Fig.4 Effect of ALA,DHA,EPAand 5-FUon the content of PGE2,LTB4,LXA4,LXA4/PGE2 in HCT116 cells注:ALA、EPA、DHA、5-FU濃度分別為200、160、120、10 μmol/L,脂肪酸和5-FU處理組分別進行顯著性分析,柱狀圖上的不同字母表示數(shù)據(jù)間有顯著差異(p<0.05),圖5同。

2.6 脂肪酸代謝產物PGE2、LTB4、LXA4對癌細胞增殖的影響

如圖5所示,將HCT116細胞暴露于不同處理濃度的PGE2(5、50、500 nmol/L),LTB4(5、50、500 nmol/L),LXA4(0.5、5、50 nmol/L)中,細胞存活率不同。低濃度的PGE2基本不影響結腸癌細胞的增殖,當濃度升高至500 nmol/L可抑制HCT116細胞增殖。與此相反的是,LTB4促進結腸癌HCT116細胞的增殖。而當癌細胞暴露于LXA4中,細胞存活率顯著下降(p<0.05),隨著濃度的增加逐漸抑制細胞的生長。

圖5 PGE2、LTB4、LXA4對HCT116細胞存活率的影響Fig.5 Effect of PGE2,LTB4 and LXA4 on HCT116 cell viability注:“-”表示未添加,“+”表示添加濃度為5 nmol/L,“++”表示添加濃度為50 nmol/L,“+++”表示添加濃度為500 nmol/L。

3 討論

癌細胞中的Δ5和Δ6脫氫酶活力低于正常細胞,導致腫瘤細胞內長鏈多不飽和脂肪酸GLA,AA,EPA和DHA含量相對較少[12-15],經研究結果表明結腸癌HCT116脂肪酸主要為飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸(>90%)。多不飽和脂肪酸極易誘發(fā)自由基的聚積和脂質過氧化進程而對癌細胞有毒性作用[16],因此,腫瘤細胞內較低的脫氫酶活力是其保護自我的防御機制。外源性添加多不飽和脂肪酸(ALA,DHA,EPA),通過細胞膜以脂滴形式儲存于細胞質內,改變癌細胞內的脂肪酸組成,提高不飽和脂肪酸比例,抑制HCT116細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn),外源添加n-3 PUFAs(ALA,DHA,EPA)顯著提高了癌細胞內DHA和EPA的含量(p<0.05)。EPA和DHA既能在癌細胞內代謝生成促炎因子PGs、TXs、LTs,又能產生抗炎分子脂氧素LXs、消散素RSVs、保護素PTs、巨噬細胞源消散素,此二類代謝產物在生物體內的平衡決定著腫瘤細胞的增殖和遷移能力[5,11]。HCT116細胞中LTB4的分泌量在脂肪酸添加后較空白對照組下降,而PGE2和LXA4的水平上升。值得注意的是,盡管DHA、EPA和ALA處理組中PGE2和LXA4的含量均被提高,但LXA4/PGE2的比例較空白對照組顯著上升(p<0.05),表明DHA、EPA和ALA對癌細胞的毒性作用更主要的是提升LXA4含量,使癌細胞趨向于抗炎狀態(tài)。

本研究首次報道了LXA4在多不飽和脂肪酸抑制結腸癌細胞方面的作用,過往研究認為EPA和DHA主要是通過抑制COX-2表達發(fā)揮抑癌作用[9]。DAS等[6]與Polavarapu等[17]研究發(fā)現(xiàn)LXA4對腫瘤細胞具有直接抑制作用。將HCT116細胞暴露于不同處理濃度的PGE2、LTB4、LXA4中,發(fā)現(xiàn)LTB4明顯促進結腸癌細胞的增殖,而PGE2和LXA4卻能顯著抑制結腸癌細胞增殖(p<0.05),且LXA4對癌細胞的抑制效果明顯強于PGE2,0.5 nmol/L 的LXA4即可使兩細胞存活率顯著下降(p<0.05)。因而我們推測PUFAs的抑癌作用關鍵在于其促進了LXA4分泌,抑制了LTB4生成,而與PGE2的關系不大。

盡管PUFAs和5-FU處理均抑制了結腸癌細胞HCT116的生長,但其作用后癌細胞內脂肪酸組成和PGE2、LTB4、LXA4的分泌卻存在較大差異。由此說明陽性藥物5-FU對HCT116細胞的抑制作用不同于n-3 PUFAs,我們需要歸納總結PUFAs作用機制。癌細胞中的Δ5和Δ6脫氫酶活力不足并伴隨著花生四烯酸AA,EPA和DHA含量降低,導致PGE2合成增加作為代償機制[18]。研究發(fā)現(xiàn)炎性環(huán)境(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、癌癥)下多不飽和脂肪酸含量較低并伴有血液和體液PGE2水平顯著增高[19-21]。Tateishi等[22]在動物實驗中研究發(fā)現(xiàn),患結腸炎癥的小鼠口服AA后,其LXA4生成量顯著增加,而PGE2分泌量無明顯變化。以上研究表明,體內EPA和DHA水平較低時,外源添加上述脂肪酸可增加LXA4產生,而PGE2的生成量變化不大。由此可見,升高LXA4的生成量比PGE2能更有效地終止炎癥狀態(tài)(癌癥也是一種炎癥狀態(tài)),且MTT實驗證明LXA4對結腸癌細胞HCT116具有直接抑制作用。

綜上所述,我們推測多不飽和脂肪酸可通過改變脂肪酸代謝產物促炎因子PGE2和LTB4和抗炎因子脂氧素、消散素、保護素和巨噬細胞源消散素的分泌發(fā)揮細胞毒性作用。

4 結論

n-3多不飽和脂肪酸(ALA、EPA、DHA)和5-FU對HCT116細胞的生長具有顯著的抑制作用和誘導凋亡作用,來源于海洋魚類不飽和程度更高的脂肪酸EPA和DHA較來源于植物油的ALA表現(xiàn)出更強的抗結腸癌活性。ALA、EPA、DHA促進HCT116細胞內脂滴積聚狀態(tài),提高不飽和脂肪酸比例,降低LTB4積累,提高LXA4/PGE2比率,使癌細胞趨向于抗炎狀態(tài),進而對HCT116細胞產生殺傷作用。