響應(yīng)面法優(yōu)化大白菜腌制條件

褚路路,楊麗聰,鄭國棟

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045)

眾所周知,蔬菜中富含豐富的維生素、礦物質(zhì)、纖維素等人體不可缺少的營養(yǎng)成分,是人類餐桌上必不可少的一種食物。伴隨而來是多種蔬菜加工方式的出現(xiàn),其中,蔬菜腌制是中國應(yīng)用最普遍、最古老的蔬菜加工方法,是一種將新鮮蔬菜經(jīng)預(yù)處理后,利用高濃度鹽液、乳酸菌發(fā)酵來保藏蔬菜,并通過腌制增進(jìn)蔬菜風(fēng)味以賦予其新鮮滋味的方法[1],發(fā)酵蔬菜、泡菜、榨菜等都屬于腌制蔬菜的范疇。

蔬菜在生長過程中易富集硝酸鹽,在腌制過程中,腌制蔬菜易被雜菌污染,如果加入食鹽量少于10%,蔬菜中的硝酸鹽極易被微生物還原成亞硝酸鹽[2-4]。隨著腌制時(shí)間的增加,腌制蔬菜中亞硝酸鹽的含量不斷增加,一周后可達(dá)到高峰,甚至可持續(xù)2～3周,20 d后亞硝酸鹽含量會(huì)逐漸下降,達(dá)到安全食用標(biāo)準(zhǔn)。亞硝酸鹽毒性較強(qiáng),人體食用0.2～0.5 g亞硝酸鹽或硝酸鹽就會(huì)引起中毒[5-6],使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,失去攜氧能力而引起組織局部缺氧造成缺氧損傷。硝酸鹽不但可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥,還會(huì)與食物中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而生成強(qiáng)致癌物質(zhì)—亞硝胺。亞硝酸鹽與胺類或酰胺類同時(shí)存在,孕婦過量攝入可能造成胎兒致癌、畸形、甚至死亡[7]。因此腌制蔬菜中亞硝酸鹽含量測(cè)定是食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的必測(cè)項(xiàng)目之一。

傳統(tǒng)腌制方法只能通過規(guī)范腌制天數(shù)來和接種發(fā)酵[8]來降低亞硝酸鹽的含量,本實(shí)驗(yàn)綜合考慮發(fā)酵條件和添加物[9]對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量生成的影響。本文以腌制大白菜中亞硝酸鹽的含量變化動(dòng)態(tài)過程為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),采用國標(biāo)法(GB/T 5009.33)—鹽酸萘乙二胺法,探究了維生素C加入量、食用醋酸加入量、腌制時(shí)間三個(gè)因素對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的影響,通過響應(yīng)面優(yōu)化尋求最佳的腌制條件和輔料比例,旨在減輕腌制菜中亞硝酸鹽含量過高對(duì)食用者的威脅,同時(shí)為更深入探究其它腌制菜中的亞硝酸鹽含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料大白菜(生長在南昌郊區(qū)蔬菜基地,品種為超級(jí)白菜,青白幫,花心直筒型,)、食鹽等 南昌批發(fā)超市;食用醋酸(含量≥99.5%) 濟(jì)南鴻橋化工有限公司;維生素C、活性炭、飽和硼砂溶液、乙酸鋅、格氏粉劑 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;亞鐵氰化鉀、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;以上所有化學(xué)試劑均為分析純。

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;YP202電子天平 上海富雪生物科技有限公司;GPX-9248A保溫箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腌制方法 取200 g清洗后的大白菜,切碎后放入腌制壇中,在加入10%食鹽的基礎(chǔ)上,分別加入不同濃度的維生素C和食用醋酸,并攪拌均勻,最后封壇,在25 ℃條件下腌制30 d。

1.2.2 腌制過程亞硝酸鹽含量的變化 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,作為空白對(duì)照組在25 ℃條件下進(jìn)行腌制,分別測(cè)定第2、4、6、8、10、15、20、25、30 d時(shí)測(cè)腌制大白菜中的亞硝酸鹽含量。

1.2.3 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至10 mg/L,4 ℃保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確量取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液(10 mg/L),加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液,混合均勻,靜置5 min再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液,加水稀釋至50 mL,混勻,靜置15 min,樣品液通過分光光度計(jì)在波長538 nm處測(cè)定吸光度值,以亞硝酸鈉含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10-12]。

1.2.3.2 腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的測(cè)定 取一定量的腌制大白菜切成小塊,混勻,稱取200 g,將試樣置于榨汁機(jī)內(nèi),加蒸餾水200 mL,打成勻漿狀后全部移入 500 mL燒杯中備用。稱取勻漿40 g置50 mL燒杯中,用70 ℃的蒸餾水約150 mL分幾次將其沖洗入250 mL容量瓶中,加入6 mL飽和硼砂溶液并搖勻,加入2 g活性炭脫色,然后再加入2 mL乙酸鋅溶液和2 mL亞鐵氰化鉀溶液振搖4 min,以沉淀蛋白質(zhì)。加水稀釋至刻度,搖勻,用真空泵過濾,濾液用于測(cè)定。吸取5.0 mL制備好的濾液于10 mL比色管中,加入 40 mg格氏粉劑,混勻,如未溶解可加熱使溶解,放置5 min后,于波長538 nm處測(cè)定吸光度,樣品每組平行測(cè)三次,記錄吸光值,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出腌制蔬菜中亞硝酸鹽的含量。

式中：X為試樣中亞硝酸鹽的含量,單位為毫克每千克(mg/kg);A為測(cè)定用樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量,單位為微克(μg);M為試樣質(zhì)量,單位為克(g);V2為測(cè)定用樣液體積,單位為毫升(mL);V1為試樣處理液總體積,單位為毫升(mL)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 維生素濃度對(duì)腌菜中亞硝酸鹽的影響 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,食用醋酸10%進(jìn)行腌制,腌制過程中加入不同量的維生素C 0、0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%,25 ℃下在腌制25 d,測(cè)定亞硝酸鹽的含量,探究維生素C對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.4.2 食用醋酸濃度對(duì)腌菜中亞硝酸鹽的影響 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,維生素C 0.2%,腌制過程中加入不同量的食用醋酸0、4%、6%、8%、10%、12%、14%,25 ℃下在腌制25 d,測(cè)定亞硝酸鹽的含量,探究食用醋酸含量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.4.3 溫度對(duì)腌菜中亞硝酸鹽的影響 取200 g處理干凈的大白菜,加入食鹽10%,維生素C 0.2%,食用醋酸10%,分別在20、25、30、35、40、50 ℃溫度條件下腌制25 d,測(cè)定亞硝酸鹽的含量,探究溫度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 通過對(duì)影響腌制大白菜中亞硝酸含量的三個(gè)因素:維生素C加入量、食用醋酸加入量、腌制時(shí)間進(jìn)行單因素分析,采用Design-Expert.V8.0.6.1設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),因素水平見表1。

表1 腌制大白菜中亞硝酸鹽響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼Table 1 Experimental factors and horizontal coding of nitrite response surface in pickled cabbage

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行三次,結(jié)果表示為平均值±SD。數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行分析,然后用SPSS 21(IBM software,NY,USA)進(jìn)行Duncan’s檢驗(yàn)。顯著水平設(shè)置為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo),亞硝酸鹽(亞硝酸鈉)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.8126X-0.074,R2=0.999,在(0～5.0) mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of nitrite

2.2 腌制過程亞硝酸鹽含量的變化

由圖2可以看出:在腌制第8 d亞硝酸鹽的含量達(dá)到頂峰,高于60.0 mg/kg,嚴(yán)重超出了國標(biāo)規(guī)定(GB 2714-2015食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 醬腌菜)低于20.0 mg/kg的范圍。在第8 d之后,隨著時(shí)間的增加亞硝酸鹽的含量逐漸下降,在20 d時(shí),亞硝酸鹽的含量為19.8 mg/kg低于國標(biāo)20.0 mg/kg,并且之后含量也是逐漸降低的,在25 d下降到17.9 mg/kg,食用相對(duì)安全。隨著腌制天數(shù)的增加亞硝酸鹽含量先增加后降低,這與岳向冰[13]探究結(jié)果一致,只有保證足夠的腌制天數(shù),才能確保亞硝酸鹽含量不超過國標(biāo)。因此,接下來的單因素實(shí)驗(yàn)均在腌制時(shí)間25 d后進(jìn)行亞硝酸鹽的含量測(cè)定。

圖2 腌制天數(shù)對(duì)亞硝酸鹽的影響Fig.2 The effect of curing days on nitrite

2.3 單因素試驗(yàn)對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響

2.3.1 維生素C濃度對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響 維生素C的加入量對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響比較大。如圖3所示,由圖3可知,在腌制25 d時(shí),亞硝酸鹽含量隨著維生素C添加量的增加而降低隨后趨于平穩(wěn),維生素C添加量在0.01%～0.20%下降,0.02%～0.25%趨于平緩,在0.20%后趨于穩(wěn)定并出現(xiàn)最低值,其含量為15.1 mg/kg。因此,腌制過程中維生素C的最佳加入量為0.20%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與徐海斌[14]研究的腌制大頭菜亞硝酸鹽含量及降低措施研究的結(jié)果一致,維生素C、食用醋酸、溫度都會(huì)對(duì)腌制菜中亞硝酸鹽含量有影響。維生素C作為氧化劑,在腌制過程中可以有效的防止微生物對(duì)硝酸鹽的還原,使得亞硝酸鹽含量降低。食用醋酸的加入不僅可以調(diào)節(jié)腌制菜的風(fēng)味口感,而且起到降低亞硝酸鹽含量的目的。因此,腌制過程中維生素C的最佳加入量為0.20%。

圖3 維生素C對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響Fig.3 The effect of vitamin C on the content of nitrite in pickled cabbage

2.3.2 食用醋酸含量對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響 食用醋酸的加入量對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響如圖4所示,由圖4可知,亞硝酸鹽含量隨著食用醋酸添加量的增加總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),當(dāng)食用醋酸添加量在10%～12%時(shí),亞硝酸鹽含量有一個(gè)小的上升波動(dòng)過程,食用醋酸含量12%時(shí),亞硝酸鹽含量16.5 mg/kg。食用醋酸含量增加到14%時(shí),亞硝酸鹽含量降低到16.2 mg/kg,與食用醋酸添加量為10%時(shí)的亞硝酸鹽含量(16.3 mg/kg)相差很小。pH的降低會(huì)使微生物生長受限并且亞硝酸鹽在食用醋酸存在下可以分解[15],食用醋酸含量在10%之后亞硝酸鹽含量有升高趨勢(shì),可能是因?yàn)檫^量的食用醋酸也抑制了乳酸菌,使得亞硝酸鹽含量升高?？紤]生產(chǎn)成本以及過量酸加入會(huì)影響口感,所以最適食用醋酸含量范圍8%～10%。

圖4 食用醋酸對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響Fig.4 The effect of acetic acid on the content of nitrite in pickled cabbage

2.3.3 腌制溫度對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響 溫度對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響如圖5所示,由圖5可知,亞硝酸鹽含量在20～25 ℃隨著腌制溫度的增加降低,在25～35 ℃隨著溫度的增加而增加,35 ℃后降低,在35 ℃時(shí)最高為18.4 mg/kg。亞硝酸鹽含量隨著溫度的變化趨勢(shì)是由微生物決定的,溫度低于20 ℃時(shí),微生物生長受到抑制,乳酸菌很大程度發(fā)酵收到抑制[16],同樣硝酸還原菌的活力也受到抑制。硝酸還原菌活力受到抑制,但是還原反應(yīng)仍然在緩慢進(jìn)行,所以低溫發(fā)酵只是延緩了亞硝酸鹽高峰值的到來,延長了腌制周期[17]。25～35 ℃隨著溫度的增加,亞硝酸鹽含量增加,亞硝酸鹽含量的高峰值到來比較早,可能因?yàn)樵谶m宜的溫度范圍下有害微生物充分產(chǎn)生亞硝酸鹽,故在25～35 ℃下亞硝酸鹽含量升高,并且在35 ℃達(dá)到最大值。而35 ℃以后,過高的溫度抑制微生物生長,所以亞硝酸含量有所降低。為了縮短生產(chǎn)周期和減少成本并保證亞硝酸鹽含量較低,綜合考慮,最適腌制溫度范圍為20～30 ℃。

圖5 溫度對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量影響Fig.5 The effect of temperature on the content of nitrite in pickled cabbage

2.4 響應(yīng)面結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Design-Expert.V8.0.6.1對(duì)腌制菜中亞硝酸鹽含量進(jìn)行分析[15,18-20],結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Response surface design scheme and results

2.4.2 方差分析及回歸方程擬合 采用Design-Expert.V8.0.6.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,如表3所示。采用方差分析各因素對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的影響情況,該模型的F值為660.99,表明二次回歸方差具有顯著意義。p<0.0001,表明相關(guān)系數(shù)具有顯著水平,并且該模型適用于對(duì)腌制菜中亞硝酸鹽含量結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知,各影響因素對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的主次順序?yàn)?食用醋酸含量>溫度>維生素C含量。

表3 亞硝酸鹽含量回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of nitrite content regression model

2.4.3 各因素交互影響 Design Expert.V8.0.6.1軟件處理而得的三維響應(yīng)面圖用以闡述三個(gè)因素的交互作用和關(guān)系。三維響應(yīng)面圖反映變量間的交互作用,圖6A為維生素C含量和食用醋酸含量對(duì)腌制菜中亞硝酸鹽含量的交互作用,當(dāng)維生素C含量從0.15%增至0.23%、食用醋酸含量從8%升至11.37%,亞硝酸鹽含量顯著降低,維生素C超過0.23%和食用醋酸超過11.37%后,亞硝酸鹽含量趨于升高,并且維生素C和食用醋酸含量作用效果顯著(p<0.05)。但是維生素C和溫度以及溫度和食用醋酸的協(xié)同作用不顯著,如圖6B、圖6C。

圖6 兩兩因素交互作用對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 The effects of two factors on the nitrate content in pickled cabbage

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過Design Expert.V 8.0.6.1求解方程,得出最優(yōu)條件:食用醋酸加入量11.37%,腌制溫度21.24 ℃,維生素C加入量0.23%,腌制25 d,考慮到實(shí)際運(yùn)用和腌制條件的可操作性采用最優(yōu)腌制條件：食用醋酸加入量11%，腌制溫度21 ℃,維生素C加入量0.2%，腌制時(shí)間21 d,平行三組實(shí)驗(yàn)測(cè)得腌制大白菜中亞硝酸鹽含量平均值為16.47 mg/kg,顯著優(yōu)于空白組17.9 mg/kg(p<0.05)與理論預(yù)測(cè)值(16.38 mg/kg)相差0.5%,表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化腌制大白菜中亞硝酸鹽含量具有良好的真實(shí)可靠性。

3 結(jié)論

本文探究了大白菜腌制過程中的亞硝酸鹽含量變化,并得知腌制大白菜一定要保證腌制的天數(shù)足夠,才能避免因誤食腌制天數(shù)不足而造成的亞硝酸鹽中毒。腌制大白菜在20 d時(shí),亞硝酸鹽的含量為19.8 mg/kg低于國標(biāo)20 mg/kg,且之后也是逐漸降低,在25 d的時(shí)候降到17.9 mg/kg,并趨于相對(duì)穩(wěn)定,食用相對(duì)安全。食用醋酸加入量、腌制溫度、維生素C對(duì)腌制大白菜中亞硝酸鹽產(chǎn)生量都有顯著影響,并且各影響因素對(duì)腌制菜中亞硝酸鹽含量的主次順序?yàn)?食用醋酸含量>溫度>維生素C含量。腌制25 d時(shí),利用響應(yīng)面優(yōu)化法最終得到最佳腌制條件為:食用醋酸加入量11%,腌制溫度21 ℃,維生素C加入量0.2%,并檢測(cè)得到腌制大白菜中亞硝酸鹽含量16.47 mg/kg,顯著低于空白組17.9 mg/kg數(shù)值(p<0.05)。因此本文優(yōu)化腌制條件對(duì)生產(chǎn)生活具有良好的指導(dǎo)意義,并為更深入探究其他腌制菜中的亞硝酸鹽含量提供依據(jù)。