lncRNA-AB073614在U251細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

蘇龍，林濤，車(chē)海江，郭世文

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710061；2西電集團(tuán)醫(yī)院)

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的成人原發(fā)性腦腫瘤，約占顱內(nèi)惡性腫瘤的80%[1]。腦膠質(zhì)瘤根據(jù)病理組織惡性程度分為WHO Ⅰ～Ⅳ級(jí)，通常認(rèn)為 Ⅰ～Ⅱ級(jí)是低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤， Ⅲ～Ⅳ級(jí)是高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤[2,3]。盡管臨床上腦膠質(zhì)瘤的治療已取得一些進(jìn)展，包括手術(shù)切除以及術(shù)后放化療等，但絕大部分患者預(yù)后仍較差，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，術(shù)后生存期為9～12個(gè)月，5年生存率低于10%[4～6]。而目前相關(guān)研究顯示，腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制仍不清楚。因此，探索腦膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制，尋找更有效的治療方法迫在眉睫。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)氨基酸的RNA，其不具備蛋白質(zhì)編碼能力，但可通過(guò)干擾mRNA剪切、降解和翻譯等過(guò)程發(fā)揮作用[7,8]?，F(xiàn)有研究[9,10]表明，lncRNA在腫瘤與正常組織中存在差異表達(dá)，且與多種腫瘤疾病的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等過(guò)程。lncRNA-AB073614是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)異常增加，且是影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其對(duì)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制仍不清楚[11,12]。本研究觀察了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-AB073614表達(dá)變化及小分子干擾RNA片段(si-RNA)轉(zhuǎn)染對(duì)其細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，旨在為腦膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療尋找新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、儀器及試劑 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA均購(gòu)自中科院上海生命研究院；10%胎牛血清(FBS)、Opti-MEM、DMSO試劑、MTT試劑、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液均購(gòu)自美國(guó)Gbico公司；胰酶消化液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；TRIzol、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、AB073614引物均購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)自BD公司；si-RNA干擾序列由Life公司提供；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel購(gòu)自BD公司；7300型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 U251細(xì)胞、NHA細(xì)胞AB073614檢測(cè) U251細(xì)胞及NHA細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度是37 ℃，CO2濃度為5%。TRIzol法提取U251、NHA細(xì)胞的總RNA，用分光光度計(jì)定量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cRNA，生成條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、10 min。cDNA稀釋成10倍后放于-20 ℃保存，待后續(xù)使用。選擇GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt表示，所有實(shí)驗(yàn)操作至少重復(fù)3次。用7300型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，AB073614引物正義鏈：5′-ATTTCTGCTCCTGGGTCTTAC-3′，反義鏈：5′-AGTGGCTTGTCTGTTAGAGTC-3′；內(nèi)參GAPDH正義鏈：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，反義鏈5′- CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.3 U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力檢測(cè) ①細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d，將生長(zhǎng)良好的U251細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心后，取50×103個(gè)/瓶，接種于6孔板含10%FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，待6孔板中細(xì)胞匯合度在70%～80%時(shí)進(jìn)行Opti-MEM、Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)48 h。以此建立細(xì)胞模型，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：采用MTT實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染si-AB073614后的U251細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞分別接種于96孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為0、24、48、72、96 h，培養(yǎng)后加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，再次放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，并在每個(gè)孔中加入DMSO 150 μL，輕輕震蕩混勻后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm處的吸光度值，根據(jù)測(cè)量結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，比較細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。③細(xì)胞遷移能力檢測(cè)：采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將si-AB073614處理U251細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞傳代重懸后，分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量細(xì)胞的濃度，計(jì)算出目前細(xì)胞總數(shù)目，將相同數(shù)目的細(xì)胞接種到35 mm的培養(yǎng)皿中，在其底部做好標(biāo)記，可清楚識(shí)別分割區(qū)域，細(xì)胞匯合度在50%～60%，每個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液在2 mL即可，體積不足用培養(yǎng)液配平，細(xì)胞接種后在4 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)，用200 μL槍頭進(jìn)行劃線(xiàn)，使觀察區(qū)域達(dá)到4～6個(gè)，劃線(xiàn)后倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗2次，洗掉懸浮的死細(xì)胞，重新加入完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，每隔6～12 h觀察傷口愈合情況，并拍攝相應(yīng)的普光和熒光照片。36～48 h后結(jié)束觀察。所有實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次，取平均值。比較細(xì)胞遷移能力。④細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：采用Transwell實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前將基質(zhì)膠置于冰盒中，保持液體狀態(tài)，在Transwell小室里分別加入200 μL的DMEM并放入到溫箱中進(jìn)行水化1 h。鋪基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)中，水化后吸去200 μL的DMEM，在小室中加入基質(zhì)膠與DMEM的混合液60 μL，放入溫箱中培養(yǎng)30 min使其凝固，待基底膜干燥后，滴入單細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞穿透基底膜的數(shù)量，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 U251、NHA細(xì)胞AB073614表達(dá)比較 U251、NHA細(xì)胞中AB073614表達(dá)水平分別為3.57±0.28、1.00±0.17，兩者比較，P<0.05。

2.2 U251細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力比較 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，si-AB073614處理的U251細(xì)胞存活率顯著低于未轉(zhuǎn)染的(P<0.05)，提示敲除U251細(xì)胞內(nèi)AB073614的表達(dá)后，可明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力(見(jiàn)圖1A)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，si-AB073614處理的U251細(xì)胞遷移能力明顯低于未轉(zhuǎn)染的(P<0.05)，詳細(xì)見(jiàn)圖1B。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，si-AB073614處理的U251細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于未轉(zhuǎn)染的(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1C。上述結(jié)果說(shuō)明，抑制AB073614表達(dá)，可明顯降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。

圖1 si-AB073614轉(zhuǎn)染對(duì)U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，在中國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，同時(shí)因其惡性程度高、預(yù)后差，越來(lái)越受到人們的關(guān)注，急需新的治療方法及腫瘤標(biāo)記靶點(diǎn)用于腦膠質(zhì)瘤的診斷和治療[13,14]。以往對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的研究主要集中在與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞異常分化、細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞外基質(zhì)降解、基底膜破壞等方面[15]。近年研究表明，lncRNA可參與基因組的修飾、類(lèi)似ceRNA作用參與對(duì)靶基因調(diào)控、結(jié)合特異性DNA或RNA對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。隨著對(duì)lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究越來(lái)越多，使其成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[16,17]。文獻(xiàn)[18]報(bào)道，腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞可見(jiàn)lncRNA-ATB，并發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移過(guò)程，這說(shuō)明lncRNA-ATB與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。另外學(xué)者對(duì)lncRNA-MEG3、CRNDE等在腦膠質(zhì)瘤中的作用也進(jìn)行了深入研究[19,20]，而反觀lncRNA-AB073614只是在其他惡性腫瘤組織中證實(shí)表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且在這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但對(duì)lncRNA-AB073614在腦膠質(zhì)瘤領(lǐng)域的研究較少[21]。

lncRNA-AB073614是一種最新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，以往研究主要集中在其與結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的關(guān)系方面。Xue等[22]對(duì)lncRNA AB073614在結(jié)直腸癌中的作用研究結(jié)果顯示，在SW480和HCT116細(xì)胞中，lncRNA-AB073614敲除后顯著促進(jìn)了E-cadherin和Occludin蛋白表達(dá)水平，并降低了N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，進(jìn)一步降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力，影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Cheng等[23]發(fā)現(xiàn)，在HO-8910細(xì)胞和OVCAR3細(xì)胞中，敲低AB073614表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖和侵襲，導(dǎo)致細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞停滯和凋亡增加，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還證實(shí)敲低AB073614可抑制OVCAR3細(xì)胞增殖，AB073614在卵巢癌發(fā)育中充當(dāng)功能性癌基因的作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。研究[24]認(rèn)為，lncRNA-AB073614表達(dá)SOX7抑制胃癌的發(fā)生和進(jìn)展，且lncRNA-AB073614表達(dá)與胃癌的腫瘤體積、TNM分期、血管神經(jīng)浸潤(rùn)等明顯相關(guān)，因此可以作為胃癌早期診斷的重要指標(biāo)。Sun等[25]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AB073614在乳腺癌的擴(kuò)散、浸潤(rùn)發(fā)揮重要作用，通過(guò)表達(dá)SOX7和AXIN2發(fā)揮作用，兩者的表達(dá)均與乳腺癌腫瘤的體積、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等相關(guān)，影響乳腺癌癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。研究證實(shí)，AB073614在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常腦組織，且可作為預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，然而對(duì)于AB073614在腦膠質(zhì)瘤中的具體作用機(jī)制作者并未提及。因此，我們的研究重點(diǎn)是在此基礎(chǔ)上，探討AB073614在體外腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)以及作用。本研究顯示，AB073614在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。本研究還顯示，敲除AB073614的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力明顯減弱，提示敲除AB073614基因可能對(duì)腫瘤的進(jìn)展具有抑制作用。

總之，U251細(xì)胞中AB073614表達(dá)升高，si-RNA轉(zhuǎn)染AB073614能明顯抑制其增殖、侵襲、遷移能力。