江西野生金線蓮莖尖染色體制作技術(shù)優(yōu)化

張付遠(yuǎn)，李丹丹,2，宋墩福

（1江西環(huán)境工程職業(yè)學(xué)院，江西贛州 341000；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州）

金線蘭屬Anoectochilus Bl.隸屬于蘭科Orchidaceae，該屬植物全世界約有30種，分布于印度、喜馬拉雅山東部、太平洋群島西南部和亞洲南部、東南部到澳大利亞地區(qū)；中國(guó)有11種，其中7種為中國(guó)特有[1]。在我國(guó)金線蘭屬植物常被稱為“金線蓮”[2]。金線蓮?fù)ǔＳ址Q花葉開(kāi)唇蘭、金線蘭、鳥(niǎo)人參，是珍稀名貴中草藥，可全草入藥，性平味甘，清熱涼血，祛風(fēng)利濕，可用于治療支氣管炎、腎炎、結(jié)核性腦膜炎、咳血、小兒急驚風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥[3-4]。但是金線蓮對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，且數(shù)量少，遠(yuǎn)不能滿足需求[5]。因此，國(guó)內(nèi)已通過(guò)組培快繁方法建立無(wú)性系植株，目前對(duì)金線蓮的研究還只限于植物學(xué)描述、資源評(píng)價(jià)、化學(xué)有效成分、藥理機(jī)制、藥效成分的提取工藝、組培快繁、栽培及少部分分子標(biāo)記的研究，曾雅娟等[6]（2001）曾有報(bào)道了金線蓮的染色體核型屬不對(duì)稱“2 A”類型，核型公式2n=40=38m+2sm。但是圖像不夠清晰。

為了給金線蓮育種和栽培提供詳細(xì)遺傳背景資料，現(xiàn)對(duì)其染色體進(jìn)行觀察，并在結(jié)合前人染色體制片技術(shù)的基礎(chǔ)上，用金線蓮組培瓶苗莖尖體為材料，得到了簡(jiǎn)單有效穩(wěn)定的染色體制片方法，以期為金線蓮的種質(zhì)資源分類、遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近鑒定、種質(zhì)資源創(chuàng)新及利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用材料為江西野生金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.組培瓶苗的莖尖，取自江西環(huán)境工程職業(yè)學(xué)院花卉中心。

1.2 方法

1.2.1 取材。取金線蓮組培幼苗，切取1cm左右長(zhǎng)的莖尖。從8∶30～17∶30，每隔2h取材1次。

1.2.2 預(yù)處理。將根尖置于0.1%的秋水仙素中分別預(yù)處理 1h、2h、4h、6h。

1.2.3 固定保存。將預(yù)處理過(guò)的莖尖放入卡諾液中固定24h，用自來(lái)水沖洗5遍，可以直接進(jìn)行解離，如暫時(shí)不做解離可保存在70%酒精中，于4℃冷藏備用。

1.2.4 解離。固定過(guò)的莖尖置于1mol/LHCl中在60℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行解離，解離時(shí)間設(shè)定為5min、10min和15min。

1.2.5 染色。將解離好的莖尖用蒸餾水沖洗5遍，并用改良的苯酚品紅染色液進(jìn)行染色，染色時(shí)間設(shè)定為4min、8min、16min。

1.2.6 壓片鏡檢。切取莖尖分生區(qū)部分置于載玻片上，蓋上蓋玻片，先用鑷子輕敲，最后用鉛筆的橡皮頭敲蓋玻片使染色體均勻分散。將壓好的片子置于顯微鏡下鏡檢，尋找到清晰的細(xì)胞中期分裂相并拍照取像。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染色時(shí)間對(duì)染色體觀察的影響

結(jié)果表明，采用改良的苯酚品紅溶液染色4min時(shí)，染色體著色比較淺；染色8min時(shí)，染色體染色清晰，細(xì)胞質(zhì)不染色或顏色較淡，染色效果較佳；而當(dāng)染色16min時(shí)，背景的清晰度較差，較難觀察染色體。

2.2 不同解離時(shí)間對(duì)染色體制片的影響

不同解離時(shí)間對(duì)制片效果的影響見(jiàn)表1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1mol/L的HCl在60℃下解離10min時(shí)，金線蓮莖尖細(xì)胞分散較好，染色體清晰。解離5min時(shí)，染色體互相重疊，無(wú)法清晰分辨染色體。解離15min時(shí)，部分細(xì)胞破裂，染色體出現(xiàn)缺失或混雜。

表1 不同解離時(shí)間的效果比較

2.3 不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)染色體制片的影響

如表2所示，經(jīng)0.1%的秋水仙素預(yù)處理2h后，可獲得到較多的染色體形態(tài)清晰的中期分裂相細(xì)胞。預(yù)處理1h時(shí)，染色體過(guò)長(zhǎng)，相互重疊交叉，不利于觀察；預(yù)處理4～6h時(shí)染色體過(guò)分收縮，影響染色體形態(tài)。

表2 不同預(yù)處理時(shí)間的效果比較

2.4 不同取材時(shí)間的影響

觀察不同取材時(shí)間的對(duì)壓片效果的影響（預(yù)處理2h、解離10min、染色8min），統(tǒng)計(jì)處于分裂中期的細(xì)胞所占比例（見(jiàn)表3）。結(jié)果表明金線蓮根尖的最佳取材時(shí)間為9∶30。

表3 不同取材時(shí)間的效果比較

3 討論

根尖壓片法是植物染色體研究中應(yīng)用最為廣泛的常規(guī)技術(shù)，使用莖尖較少，但是金線蓮種子小，選取胚根上的根尖比較難，加上金線蓮大部分采用組培快繁方法，根尖上培養(yǎng)基較難洗干凈，造成取材困難，效果較差。而莖尖比較容易取材，經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)效果較好，可以作為金線蓮染色體制備方法。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，于9∶30切取金線蓮幼苗的莖尖，用0.1%的秋水仙素預(yù)處理2h，經(jīng)卡諾液固定4h后，用 1mol/L HCl于 60℃下解離10min，再用改良的苯酚品紅溶液染色8min后進(jìn)行壓片，能獲得染色體分散良好、形態(tài)清晰的壓片（圖1，400x下拍照觀察）。