不同品系及生長(zhǎng)期金線蓮的金線蓮苷含量變化研究△

陳瑩，王文義，諶賽男，黃錦芳，張雪，3，吳水生*，孫志蓉，陳菁瑛

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué) 西南醫(yī)院，重慶 400038；4.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；5.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究中心，福建 福州 350003

金線蓮又名金線蘭，為蘭科植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.的新鮮或干燥全草，是閩臺(tái)地區(qū)的珍稀草藥[1]，主產(chǎn)于福建，浙江、廣西、廣東等地亦有分布[2]，是福建省道地藥材，也是“福九味”之一[3]，被列為福建省野生藥材保護(hù)品種[4]。其性平，味甘，歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng)，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕等功效[1]，臨床常用于治療乙型肝炎、腎炎、糖尿病、高血壓、手足口病等[5-7]。隨著藥用價(jià)值的開發(fā)和市場(chǎng)需求量的增加，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大。目前，金線蓮人工栽培技術(shù)成熟，市售藥材以組織培養(yǎng)種苗移栽林下土壤或大棚基質(zhì)種植4～6 個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間的栽培金線蓮為主[8-9]。金線蓮經(jīng)長(zhǎng)期引種馴化和種質(zhì)選育，逐漸形成不同栽培品系，常見的有尖葉、本地野生、本地圓葉、大圓葉、紅霞等[3,10]?！陡＝ㄊ≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》2006 年版規(guī)定，金線蓮在夏、秋季莖葉茂盛時(shí)采收[1]，但各企業(yè)金線蓮種苗移栽時(shí)長(zhǎng)和采收期不同，行業(yè)內(nèi)無(wú)統(tǒng)一的栽培技術(shù)規(guī)范[11]，加之金線蓮具有野生、不同栽培品系、組織培養(yǎng)等來(lái)源，其品質(zhì)參差不齊，有商家將組織培養(yǎng)種苗甚至同屬植物作為產(chǎn)品的加工原料，嚴(yán)重影響金線蓮產(chǎn)品的質(zhì)量[12-13]。

目前，尚未建立合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)組織培養(yǎng)、不同栽培品系金線蓮的品質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制[14]。已有研究表明，金線蓮主要有效成分為黃酮及黃酮苷、金線蓮苷、多糖等[15-18]。金線蓮苷是從金線蘭中分離得到的糖苷類化合物，結(jié)構(gòu)為五元內(nèi)酯環(huán)的手性碳上連接葡萄糖，具有保護(hù)血管、降血糖、調(diào)血脂、抗肝病毒和保護(hù)肝細(xì)胞等作用[6,19]，是金線蓮的有效物質(zhì)及特征性成分，可作為金線蓮質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。已有研究表明，各品系金線蓮之間存在遺傳多樣性[3]，其總黃酮和核苷類成分含量也存在差異[20-21]。已有研究采用高效液相色譜法（HPLC）[22]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）[23]、超高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLCTOF-MS）[24]測(cè)定金線蓮中金線蓮苷的含量，但尚未見不同品系及生長(zhǎng)期金線蓮中金線蓮苷含量變化比較的報(bào)道。本研究以不同產(chǎn)地不同品系及生長(zhǎng)期的金線蓮為研究對(duì)象，建立HPLC-ELSD 測(cè)定金線蓮苷含量的方法，探究不同品系金線蓮在不同生長(zhǎng)期金線蓮苷含量的變化規(guī)律，為金線蓮質(zhì)量評(píng)價(jià)、優(yōu)良種質(zhì)篩選及適宜采收期的確定提供參考。

1 材料

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Alltech 3300 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)格雷斯奧泰公司）；GT-2120QTS 型超聲機(jī)（廣東固特超聲股份有限公司）；DV215CD 型十萬(wàn)分之一分析天平（奧豪斯公司）；DFY-500A 型粉碎機(jī)（上海四瑞儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

金線蓮苷對(duì)照品（批號(hào)：P08S8F43417，純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

不同品系及生長(zhǎng)期金線蓮來(lái)源于福建漳州南靖、三明永安、莆田仙游等地。其中，組織培養(yǎng)金線蓮為組織培養(yǎng)生根階段4 個(gè)月的試管苗，由來(lái)源地金線蓮種植企業(yè)提供；栽培金線蓮為試管苗經(jīng)煉苗10～15 d后再移栽林下（永安、仙游）或大棚（南靖）種植樣品，并分別于種植1、2、3、4、5、6、7、9、10、13 個(gè)月取樣；野生金線蓮為林下野生藥材（表1）。所有樣品均為在產(chǎn)地隨機(jī)采集鮮品（50 株或以上），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為蘭科開唇蘭屬金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.的新鮮全草。

表1 金線蓮樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate HilicAmide（100 mm×4.6 mm,3 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水等度洗脫（92∶8，V/V）；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器霧化室溫度為50 ℃，載氣為高純氮?dú)?，載氣流速為1.5 L·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。對(duì)照品與樣品的色譜圖見圖1。

圖1 金線蓮苷對(duì)照品與金線蓮HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取金線蓮苷對(duì)照品7.94 mg 到5 mL 量瓶中，加入甲醇制備成1.588 mg·mL-1的金線蓮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.3 供試品溶液制備

將60 ℃干燥至恒重的金線蓮粉碎，過(guò)60目篩得金線蓮粉末。取金線蓮粉末0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（功率250 W，頻率50 kHz），放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋至1 588.00、1 270.40、1 016.32、508.16、254.08、127.04、63.52、31.76 μg·mL-1，精密吸取10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1.717 1X-1.599 8（r=0.999 8），線性范圍為31.76～1 588.00 μg·mL-1。按3 倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限（LOD），按10倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ），分別為15.88、31.76 μg·mL-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.4 項(xiàng)方法制備的508.16 μg·mL-1對(duì)照品溶液10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄金線蓮苷的峰面積，金線蓮苷峰面積RSD 為1.35%；精密吸取上述對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定3 d，每天測(cè)定6次，金線蓮苷峰面積RSD為1.07%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取金線蓮樣品XYC3 粉末0.2 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)色譜條件下于0、2、6、10、12、24 h 進(jìn)樣10 μL，被測(cè)物峰面積RSD為4.69%，結(jié)果表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取同一批樣品XYC3 粉末0.2 g，共6 份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金線蓮苷含量RSD 為2.15%，結(jié)果表明該法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取2.7 項(xiàng)下已知含量的樣品（XYC3）粉末，每份0.1 g，共6 份，精密稱定，每份精密加入相同量（已知含量的100%）的金線蓮苷對(duì)照品，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1 項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果該方法的加樣回收率為92.03%，RSD 為2.26%，說(shuō)明該方法回收率良好（表2）。

表2 金線蓮中金線蓮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 含量測(cè)定

分別取樣品粉末0.2 g，精密稱定，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中金線蓮苷的含量，結(jié)果見表3。

由表3 可知，不同產(chǎn)地野生金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%～11.04%，因產(chǎn)地不同而異。三明永安不同品系組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.27%～5.54%，其含量大小由高到低為尖葉2＞本地圓葉1＞本地尖葉＞尖葉1＞本地圓葉2＞本地野生。三明永安林下移栽生長(zhǎng)1～3 個(gè)月尖葉2栽培金線蓮的金線蓮苷含量變化為“升-降-升”，種植3 個(gè)月尖葉2 的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)20.08%，紅霞栽培金線蓮的金線蓮苷含量表現(xiàn)出相似的規(guī)律，其種植6個(gè)月的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.54%。

表3 金線蓮中金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

南靖不同品系組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.74%～16.14%，由大到小依次為大圓葉＞本地野生＞本地尖葉＞本地圓葉＞尖葉。南靖不同品系栽培金線蓮不同生長(zhǎng)期的金線蓮苷含量見圖2。由圖2A 可知，本地野生金線蓮在1～4 個(gè)月生長(zhǎng)期內(nèi)金線蓮苷含量均比尖葉和本地圓葉金線蓮高，表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，在生長(zhǎng)3 個(gè)月時(shí)達(dá)到最高值21.97%；本地圓葉金線蓮的金線蓮苷含量在1～2個(gè)月時(shí)上升，在2～4 個(gè)月時(shí)下降，在生長(zhǎng)2 個(gè)月時(shí)達(dá)到最高值18.61%；尖葉金線蓮在1～4 個(gè)月生長(zhǎng)期內(nèi)金線蓮苷含量除了在3 個(gè)月時(shí)略微下降外均呈上升趨勢(shì)，在生長(zhǎng)2、4 個(gè)月時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)14.5%以上。由圖2B 可知，生長(zhǎng)1～5 個(gè)月的大圓葉金線蓮的金線蓮苷含量呈現(xiàn)鋸齒狀“降-升-降-升”的趨勢(shì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在15%以上，分別在生長(zhǎng)1、3 個(gè)月達(dá)到峰值21.29%、19.77%；本地尖葉金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1 個(gè)月時(shí)的20.72%緩慢下降到4 個(gè)月時(shí)的9.83%，到生長(zhǎng)5 個(gè)月時(shí)上升到10.68%。此外，生長(zhǎng)3～5 個(gè)月的紅霞金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在14.7%以上，在生長(zhǎng)4個(gè)月時(shí)達(dá)16.1%。

圖2 南靖不同品系金線蓮在不同生長(zhǎng)期的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3）

仙游林下栽培4～13 個(gè)月的尖葉金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖3。由圖3可知，尖葉金線蓮的金線蓮苷含量在生長(zhǎng)4～7 個(gè)月時(shí)呈“升-降-升”的趨勢(shì)，并在生長(zhǎng)7 個(gè)月時(shí)達(dá)到最高值17.22%。而在生長(zhǎng)9 個(gè)月之后，其金線蓮苷含量呈下降趨勢(shì)，生長(zhǎng)9～13 個(gè)月時(shí)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.52%～17.04%。生長(zhǎng)9 個(gè)月時(shí)含花苞金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于生長(zhǎng)9 個(gè)月的開花金線蓮，分別為17.04%、15.17%，而生長(zhǎng)10個(gè)月的開花金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于生長(zhǎng)10 個(gè)月含花苞金線蓮，分別為14.61%、13.15%，但總體上進(jìn)入花期及之后生長(zhǎng)期的尖葉金線蓮的金線蓮苷含量較生長(zhǎng)9 個(gè)月前降低。

圖3 仙游尖葉金線蓮在不同生長(zhǎng)期的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

3 討論

3.1 金線蓮苷提取和測(cè)定方法的選擇

金線蓮苷是由1 個(gè)五元環(huán)內(nèi)酯與葡萄糖連接形成的苷，在酸堿性溶劑環(huán)境下易開環(huán)分解[23]，故本研究選擇操作簡(jiǎn)便、提取效率高的超聲提取法[25]，減少中間操作步驟，保證金線蓮苷檢測(cè)的準(zhǔn)確性。研究過(guò)程中比較了不同色譜柱（C18柱和氨基柱）、不同檢測(cè)器（二極管陣列檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）對(duì)金線蓮苷保留、檢測(cè)的效果，金線蓮苷是強(qiáng)極性成分并為紫外末端吸收，應(yīng)用C18柱出峰時(shí)間早且低波長(zhǎng)下紫外吸收檢測(cè)干擾大，而應(yīng)用氨基柱可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間出峰、分離度好，結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定干擾小。與Wei 等[26]研究結(jié)果一致，均表明HPLC-ELSD 適用于金線蓮苷成分快速、有效的測(cè)定。同時(shí)，選擇粒徑更小和柱長(zhǎng)更短的氨基柱，可縮短單次樣品檢測(cè)時(shí)間，在10 min 內(nèi)即可完成目標(biāo)成分測(cè)定。

3.2 含量比較

本研究首次對(duì)不同品系及生長(zhǎng)期金線蓮的金線蓮苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明不同生長(zhǎng)方式金線蓮的金線蓮苷含量差異較大，組織培養(yǎng)、栽培和野生金線蓮的金線蓮苷含量分別為1.55%～16.14%、2.68%～21.97%和1.51%～11.40%。野生金線蓮的金線蓮苷含量極差較大，可能與產(chǎn)地樣品種質(zhì)資源和自然生長(zhǎng)時(shí)間不同有關(guān)；不同品系組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷含量與產(chǎn)地有關(guān)。南靖大圓葉組織培養(yǎng)金線蓮的金線蓮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，永安本地圓葉2 金線蓮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，可能是由于馴化引種的產(chǎn)區(qū)野生金線蓮種質(zhì)資源存在差異[4]。

同一產(chǎn)地不同品系栽培金線蓮的金線蓮苷含量在不同生長(zhǎng)期變化趨勢(shì)不同。永安尖葉和紅霞金線蓮在移栽3 個(gè)月生長(zhǎng)后期的金線蓮苷含量相對(duì)于前期均增加；南靖除尖葉金線蓮的金線蓮苷含量在1～4 個(gè)月生長(zhǎng)期內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，其他4 種品系金線蓮的金線蓮苷含量隨生長(zhǎng)期延長(zhǎng)波動(dòng)變化。其中，本地野生金線蓮的金線蓮苷含量在2～4 個(gè)月生長(zhǎng)期內(nèi)均高于其他品系金線蓮，生長(zhǎng)4 個(gè)月尖葉、本地野生和大圓葉金線蓮苷的含量均高于組織培養(yǎng)期，說(shuō)明金線蓮的金線蓮苷含量與其品系和移栽生長(zhǎng)時(shí)間有關(guān)。王海閣等[3]研究表明，大圓葉、小圓葉和尖葉金線蓮經(jīng)引種馴化已經(jīng)產(chǎn)生遺傳分化；楊彬彬[27]研究發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)地不同生長(zhǎng)階段金線蓮的金線苷含量隨種植時(shí)間增長(zhǎng)而增加；結(jié)合本研究結(jié)果提示，金線蓮苷含量受種質(zhì)資源的影響較大，同時(shí)可能與不同生長(zhǎng)期金線蓮苷生物合成量變化有關(guān)。此外，莆田仙游尖葉金線蓮的金線蓮苷含量進(jìn)入花期之后呈下降趨勢(shì)，但其含量仍顯著高于生長(zhǎng)4 個(gè)月的植株，說(shuō)明在花期前延長(zhǎng)種植時(shí)間有利于尖葉金線蓮的金線蓮苷含量的積累。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究建立了HPLC-ELSD 測(cè)定金線蓮苷含量的方法，該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，為金線蓮的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供方法參考。不同品系及生長(zhǎng)期金線蓮的金線蓮苷含量差異較大，影響較大的2 個(gè)因素是種質(zhì)資源和移栽生長(zhǎng)時(shí)間。南靖不同品系金線蓮組織培養(yǎng)苗的金線蓮苷含量均較高，可考慮作為金線蓮苷分離提取的原材料；不同品系金線蓮的金線蓮苷含量隨移栽生長(zhǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)不同，總體上栽培有利于金線蓮中金線蓮苷含量的積累；金線蓮苷含量較高的金線蓮品系有本地野生、大圓葉和尖葉。

致謝：福建省三明永安市金線蓮協(xié)會(huì)、福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心陳翔提供不同品系及生長(zhǎng)期的金線蓮樣品，馬來(lái)西亞理科大學(xué)（USM）任文輝指導(dǎo)本文撰寫。