不同低氧對大鼠肺、主動脈平滑肌細胞增殖的影響

摘要：目的 研究不同低氧對大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMCs ）、主動脈平滑肌細胞（AASMCs ）增殖的影響。方法 將原代培養(yǎng)的大鼠肺、主動脈平滑肌細胞分為對照組常氧（21% O2，74% N2，5% CO2 ）、實驗組低氧（15%O2 ，85% N2，5% CO2） ；（10% O2，85% N2，5% CO2） ；（5% O2，90% N2，5% CO2） ；（3% O2，92% N2，5% CO2），培養(yǎng)48h后通過細胞胞計數(shù)和WST-1法測定肺、主動脈平滑肌細胞的增殖并分析差異性。結(jié)果 表明PASMCs 在各個低氧濃度下均能發(fā)生增殖反應(yīng)，而在10% O2、5% O2、3% O2條件下與對照相比具有呈著性差異（P<0.01）；（AASMCs ）在3% O2條件下可發(fā)生增殖反應(yīng)且與對照相比呈著性差異（P<0.01）。結(jié)論 大鼠PASMCs和AASMCs對不同低氧濃度的敏感度不同。

關(guān)鍵詞：主動脈平滑肌細胞 肺動脈平滑肌細胞 低氧 增殖

低氧性肺動脈高壓（HPH）是高原低氧及慢性阻塞性肺疾患發(fā)展成為肺源性心臟病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HPH在高原地區(qū)較常見，但是很少發(fā)生低氧性主動脈，造成這樣現(xiàn)象的機制目前還不清楚。HPH的主要病理變化以肺動脈收縮反應(yīng)增強及肺血管結(jié)構(gòu)重建為主要特征。血管的重構(gòu)主要是動脈平滑肌細胞（ASMCs）的增殖，ASMCs增殖主要受血管外周微環(huán)境的影響，即肺泡氧分壓。高壓人體呈健康狀態(tài)時，肺血管所處的周圍肺組織中氧分壓是105 mmHg，而體循環(huán)血管所處的周圍組織器官氧分壓一般低于40 mmHg。因此，本實驗旨在從細胞水平探討不同低氧對大鼠PASMCs、AASMCs增殖的影響。

一、材料與方法

（一） 材料

雄性 200 g SD 大鼠，由空軍軍醫(yī)大學(xué)動物室提供；胎牛血清（Hyclone），非必需氨基酸（Hyclone），DMEM高糖培養(yǎng)液（Hyclone），胰酶（Hyclone），wst-1 （碧云天）、其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器為三氣細胞培養(yǎng)箱 （Heraeus）；酶標(biāo)儀（VERSAmax）；倒置相差顯微鏡（Nikon）。

（二） 方法

1.原代細胞培養(yǎng)

麻醉約200 g雄性SD大鼠，分離股動脈和肺內(nèi)第二、三級肺動脈，將分離的中層動脈條浸于10% DMEM中5min后，離心管中切碎，將沉淀后的組織塊均勻地種于培養(yǎng)瓶，加含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4h，再輕輕地翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，絕對靜止培養(yǎng)3天。實驗采用3-5代的PASMCs和AASMCs。

2.細胞增殖實驗

分別用胰酶消化PASMCs和AASMCs，用血細胞計數(shù)板計數(shù)并種于96孔板，密度為5×103細胞，常氧環(huán)境下（21%O2），貼壁培養(yǎng)24h。用含5%血清的DMEM饑餓處理24h后，分別放置于15%O2、10%O2、5%O2和3%O2的低氧環(huán)境以及21%O2的常氧環(huán)境，培養(yǎng)48h后，采用Wst-1在450 nm下測細胞的吸光度OD值，Wst-1的使用方法見使用說明書（碧云天）。

3. 統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件進行分析。

二、結(jié)果

（一） 增殖結(jié)果

各低氧組PASMCs，培養(yǎng)第1天時，增殖緩慢，到第2天時迅速開始增殖，比常氧組明顯增多，48h測OD值發(fā)現(xiàn)，在10% O2、5% O2、3% O2處理條件下PASMCs與對照相比具有呈著性差異（P <0.01），而在15%O2處理條件下，無顯著性差異；低氧組AASMCs在15% O2、10% O2和5% O2處理條件下生長速度與常氧對照組一致，而在3% O2條件下可發(fā)生增殖反應(yīng)且與對照相比呈著性差異（P<0.01），其余低氧條件下均無顯著性差異。結(jié)果表明細胞水平PASMCs比AASMCs對低氧更敏感。PASMCs與AASMCs的生長曲線如圖1。

三、結(jié)語

PASMCs和AASMCs經(jīng)過15% O2、10% O2、5% O2和3% O2一系列低氧處理后，在15% O2濃度時，PASMCs已發(fā)生增殖反應(yīng)，但AASMCs不發(fā)生增殖反應(yīng)，當(dāng)氧濃度下降到3%時，AASMCs發(fā)生增殖反應(yīng)，二者均發(fā)生增殖反應(yīng)，表明細胞水平PASMCs比AASMCs對低氧更敏感。我們認(rèn)為，可能由于血管所處周圍氧環(huán)境差異所致，肺血管長期處于富氧環(huán)境中，而體循環(huán)血管長期處于低氧環(huán)境中，Han JA 報也道在低氧3% O2通過抑制平滑肌細胞eNOS活性，加強大鼠股深動脈的收縮，提示肺動脈與股動脈對低氧反應(yīng)的本質(zhì)是一致的，只是發(fā)生低氧性血管收縮時的氧分壓不同而已，支持了主、肺動脈平滑肌細胞對低氧的敏感度不同這一觀點。

參考文獻：

[1]羅穎，李志超，張齊.慢性低氧對大鼠主動脈與肺動脈平滑肌細胞增殖影響的差異性[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006，（04）.

[2]陶慧林，王懷良，郭偉，高山紅.幾種藥物對肺主動脈平滑肌細胞增殖作用影響的比較研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2005，（03）.

[3]魏冰，杜軍保，李簡，等.高肺血流量對大鼠肺動脈壓及肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2002，（01）.

（作者簡介：魏琪，碩士，西安培華學(xué)院 助教，研究方向：蛋白材料的制備及活性研究。）