鮮濕米粉中兩種乳酸鏈球菌素的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法

劉珈伶，廖 強(qiáng)，蔣定之，陳寧周

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530001)

乳酸鏈球菌素(Nisin)，又稱乳鏈菌肽，是乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)物中一種具有活性的抗菌蛋白或多肽[1]，由34個(gè)氨基酸殘基組成，能夠有效抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌[2-3]，1969年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)確認(rèn)Nisin可用作食品防腐劑[4]。Nisin對(duì)蛋白水解酶極敏感，食用后迅速酶解成氨基酸，對(duì)人體無毒副作用[5]，已在全球60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)作為食品添加劑廣泛使用。我國(guó)衛(wèi)生部于1990年批準(zhǔn)使用,GB 2760《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)食品中乳酸鏈球菌素允許使用的范圍和限量進(jìn)行了規(guī)定。Nisin主要應(yīng)用于鮮乳及乳制品、肉及肉制品、罐頭食品、烘焙食品、飲料等食品保鮮[6]，在化工[7-8]和醫(yī)藥[9]等領(lǐng)域顯示了巨大的應(yīng)用潛力。

迄今已發(fā)現(xiàn)A、F、Q、U和Z 5種Nisin，其中以Nisin A和Nisin Z的研究最多，二者結(jié)構(gòu)相似，僅第27 位氨基酸殘基不同，Nisin A 為組氨酸，而 Nisin Z為天冬酰胺[10]。食品中Nisin的檢測(cè)方法有抑菌活性法、免疫學(xué)法、生物熒光法及其他方法。抑菌活性法包括比濁法[11]、瓊脂擴(kuò)散法[12]等，其中我國(guó)目前執(zhí)行的GB 1886.231《食品添加劑 乳酸鏈球菌素》[13]中采用的方法為美國(guó)FCC瓊脂分散法；免疫學(xué)法有酶聯(lián)免疫吸附法[13]、斑點(diǎn)免疫印跡法[14]、多克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附法[15]等；生物熒光法有ATP生物發(fā)光測(cè)定法[16]、生物傳感器檢測(cè)法[17]等；其他方法包括高效液相色譜法[18]、分光光度法[19]等。但上述方法存在操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，特異性、專屬性弱，準(zhǔn)確性、精確性及重復(fù)性低的缺點(diǎn)，無法準(zhǔn)確鑒別Nisin的種類。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有特異性好和靈敏度高的特點(diǎn)，電噴霧電離源(ESI)易形成多電荷離子，特別適于分析極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物[21]。多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)可實(shí)現(xiàn)一次質(zhì)譜進(jìn)樣對(duì)幾百乃至上千個(gè)目標(biāo)肽段進(jìn)行分析[22]。近年來應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析檢測(cè)培養(yǎng)液[23]、乳酪和牛奶[24-27]中Nisin也有報(bào)道，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)標(biāo)準(zhǔn)[28]還規(guī)定了乳酪中Nisin A的LC-MS和LC-MS/MS檢測(cè)方法。目前，在我國(guó)使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定Nisin尚屬空白。本文建立的HPLC-MS/MS快速測(cè)定鮮濕米粉中Nisin A和Nisin Z的方法，具有高效、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，可為復(fù)雜基質(zhì)中多種生物防腐劑的檢測(cè)研究及標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

鮮濕米粉樣品購(gòu)自廣西南寧市區(qū)內(nèi)部分超市、便利店及零售攤點(diǎn)。

Nisin A標(biāo)準(zhǔn)品(C143H230O37N42S7，生物試劑)、Nisin Z標(biāo)準(zhǔn)品(C141H228O38N41S7，生物試劑)均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；甲酸(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀制備的超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)；pH 3.0的水為用甲酸溶液將超純水調(diào)至pH 3.0±0.1而得。除特殊注明外，所用試劑均為分析純，所配溶液均為水溶液。

AB SCIEX TRIPLE QUAD 4500高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；Heraeus MultifugeX3R型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；ML204型分析天平(感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo公司)；Rotavapor R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；Vortex Genie 2型渦旋振蕩器(美國(guó)Scientific Industries公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取乳酸鏈球菌素Nisin A、Nisin Z標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加pH 3.0的水溶解并定容至刻度，搖勻制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。精密移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用pH 3.0的水稀釋并定容至刻度，搖勻制得質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用空白基質(zhì)溶液制成質(zhì)量濃度分別為100、200、400、800、1 000、1 500、2 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

取試樣5 g(精確至0.000 1 g)置于50 mL離心管中，加10 mL pH 3.0的水溶液，渦旋1 min，放置30 min后，振搖渦旋5 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，取濾液待上機(jī)分析。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Hilic Plus柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸(A相)、乙腈(B相)；梯度洗脫程序：0～3 min，80%～10%A；3～6 min，10%A；6～6.1 min，10%～80%A；6.1～9 min，80%A。流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；離子源溫度：600 ℃；干燥氣壓力：50.0 psi；氣簾氣壓力：35.0 psi；氣簾氣流速：30 L/min； 碰撞氣流速：6 L/min； 輔助氣流速：50 L/min；噴霧電壓：5 500 V；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；采集窗口：全段采集；駐留時(shí)間：100.00 ms； 其他參數(shù)見表1。

表1 乳酸鏈球菌素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of Nisin

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

首先采用C18、HLB和PRiME HLB 3種固相萃取柱考察了固相萃取法對(duì)陰性加標(biāo)樣品(質(zhì)量濃度1 000 μg/L)的提取凈化效果，結(jié)果顯示，Nisin A和Nisin Z均完全吸附于小柱上難以洗脫。隨后又分別考察了單獨(dú)采用不同極性有機(jī)溶劑飽和正丁醇水溶液和二氯甲烷對(duì)加標(biāo)樣品的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述溶劑對(duì)該測(cè)定體系的提取效果也極差。已有研究表明，Nisin A和Nisin Z耐酸性和耐熱性優(yōu)良，但在中性或堿性條件下即發(fā)生失活，在pH 2.0條件下，可耐受高溫處理且無活性損失[29]。隨著 pH值的升高，Nisin的溶解度大幅降低，當(dāng)pH 8.0時(shí)難溶于水。因此實(shí)驗(yàn)考察了Nisin A和Nisin Z在pH 2.0～3.0的乙酸或甲酸水溶液中的溶解度。結(jié)果顯示，兩種乳酸鏈球菌素在該條件下溶解性良好，考慮到pH 2.0的溶液酸性過大，不利于質(zhì)譜維護(hù)，且乙酸的提取效果和離子化效果均比甲酸差，最終選擇用pH 3.0的甲酸水溶液渦旋提取樣品5 min。

2.2 高效液相色譜條件的優(yōu)化

比較了CAPCELL PAK C18柱(MGⅢ-H)、Hypersil Gold C8柱、ZORBAX Hilic Plus柱等液相色譜-質(zhì)譜分析中常用色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示Hypersil Gold C8柱因保留時(shí)間較短，僅能分析Nisin A，且母離子為m/z567.1，子離子為m/z373.2和m/z431.0。CAPCELL PAK C18和ZORBAX Hilic Plus色譜柱均可分析Nisin A和Nisin Z，但CAPCELL PAK C18柱保留時(shí)間短，響應(yīng)低；ZORBAX Hilic Plus柱為親水作用色譜柱，適于分析強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性物質(zhì)，對(duì)Nisin A和Nisin Z的峰形尖銳，保留時(shí)間延長(zhǎng)至3 min后，分離度更好，實(shí)驗(yàn)最終選擇ZORBAX Hilic Plus柱為分析柱。由于Nisin屬于大分子多肽，譜峰難以達(dá)到完美的對(duì)稱，實(shí)驗(yàn)調(diào)整了流動(dòng)相A中的甲酸濃度，并使用5～10 mmol/L乙酸銨增強(qiáng)離子化效果，擴(kuò)大峰值的保留時(shí)間，調(diào)整譜峰對(duì)稱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用不同濃度乙酸銨調(diào)節(jié)的效果不理想，子離子峰仍出現(xiàn)分叉；而0.1%甲酸-乙腈為流動(dòng)相時(shí)峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適當(dāng)。實(shí)驗(yàn)最終選擇流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別考察了空白溶劑、樣品提取液在200、 1 000、1 800 μg/L 3個(gè)加標(biāo)水平下的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，Nisin A和Nisin Z在提取液中均存在嚴(yán)重的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中以空白溶劑的回收率為基準(zhǔn)，提取液Nisin A的回收率減少了53%，提取液Nisin Z的回收率減少了58%。由于本文未采用凈化處理，且目前市面上未見有Nisin A和Nisin Z的同位素內(nèi)標(biāo)，為減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正的方式對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校正。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Nisin分子結(jié)構(gòu)中包含氨基丁酸(ABA)、脫氫丙氨酸(DHA)、R-甲基脫氫丙氨酸(DHB)、羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)和己-甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)5種稀有氨基酸，活性分子常為二聚體或四聚體，在ESI源強(qiáng)電場(chǎng)作用下酸性溶液中的Nisin A和 Nisin Z容易質(zhì)子化，形成穩(wěn)定的多重電荷離子。分別配制500 μg/L的Nisin A和 Nisin Z標(biāo)準(zhǔn)溶液用針泵連續(xù)直接進(jìn)樣，優(yōu)化了噴霧電壓、離子源溫度、氣簾氣、碰撞氣、輔助加熱氣、去簇電壓、碰撞氣能量等質(zhì)譜參數(shù)，以確定化合物的母離子和子離子。實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)了Nisin A和Nisin Z的[M+4H]4+及[M+5H]5+峰，發(fā)現(xiàn)[M+5H]5+的質(zhì)荷比更高，對(duì)于多個(gè)帶電分子的分析而言，質(zhì)荷比越高特異性越強(qiáng)，因此實(shí)驗(yàn)選擇的子離子質(zhì)荷比大于母離子，并以強(qiáng)度較大的子離子作為定量離子，以強(qiáng)度略小的子離子作為定性離子。圖1為陰性樣品中添加200 μg/L Nisin A和 Nisin Z混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的總離子流圖，圖2為一陽(yáng)性樣品的MRM定量離子色譜圖。

圖1 陰性樣品中添加Nisin A和Nisin Z混合標(biāo)準(zhǔn)物溶液的總離子流圖(200 μg/L)Fig.1 Chromatogram of blank sample spiked with Nisin A and Nisin Z(200 μg/L)

圖2 陽(yáng)性樣品中Nisin A(A)和Nisin Z(B)的MRM定量離子色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of Nisin A(A) and Nisin Z(B) in a positive sample

2.5 分析方法評(píng)價(jià)

2.5.1線性關(guān)系與檢出限以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，以各組分峰面積(y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，Nisin A和Nisin Z在100～2 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程分別為y=36.265x+697.77和y=63.228x+1 796.3，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。但因LC-MS/MS的響應(yīng)值是絕對(duì)響應(yīng)值，基線噪音較高，流動(dòng)相的噪音已在103以上，因此本實(shí)驗(yàn)中線性方程的截距較大。根據(jù)對(duì)空白基質(zhì)的測(cè)定確定噪聲，以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算方法檢出限，平行測(cè)定3次，取平均值。測(cè)得Nisin A和Nisin Z的檢出限分別為0.01、0.02 mg/kg。

2.5.2回收率與精密度分別取10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.20、1.00、1.80 mL，加至5 g空白樣品中，按樣品同法處理，最終定容至10 mL，各水平平行測(cè)定6次，回收率結(jié)果如表2。Nisin A和Nisin Z的回收率為95.6%～107.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%～1.9%。說明本方法檢測(cè)結(jié)果可靠。以400 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得RSD均小于2.0%，說明本方法所得檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性好。

表2 Nisin A和Nisin Z的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standards of Nisin A and Nisin Z

2.5.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1.00 mL，加入空白樣品中，按樣品同法處理并定容至10 mL，室溫下儲(chǔ)存，并于制備后0、2、4、8、12 h進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)時(shí)間段平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，Nisin A的質(zhì)量濃度為979.558～1 000.402 mg/L，RSD為0.85%；Nisin Z的質(zhì)量濃度為986.927～1 006.954 mg/L，RSD為0.79%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本法對(duì)市售20批鮮濕米粉樣品進(jìn)行測(cè)定，樣品類型涉及即食類鮮濕米粉和非即食類鮮濕米粉的切粉(河粉、卷粉)和榨粉(圓粉)。結(jié)果有2批樣品檢出Nisin Z(含量分別為1.7、1.9 mg/kg)，1批樣品檢出Nisin A(含量為2.2 mg/kg)，其余均未檢出。檢出Nisin的批次占總批次的15%，檢出Nisin的3批次樣品均為保質(zhì)期大于3個(gè)月的即食類鮮濕米粉。本次檢測(cè)結(jié)果顯示，鮮濕米粉類產(chǎn)品中有添加乳酸鏈球菌素的現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定鮮濕米粉中兩種常見Nisin的檢測(cè)方法。以酸性溶液提取Nisin，以親水作用色譜柱Hilic Plus柱作為分析柱提高了分離效果，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)增強(qiáng)了離子的選擇性、抗干擾能力和專屬性。本方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，所得檢測(cè)結(jié)果滿意，并首次實(shí)現(xiàn)了將液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于米粉中微生物防腐劑的檢測(cè)。方法也適用于醋、醬油等食品中乳酸鏈球菌素的檢測(cè)，可為食品安全標(biāo)準(zhǔn)的制定及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)支持。