固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定地表水中10種抗病毒藥物

劉先軍，羅 波，馮家力，曾 棟，李幫銳，陳東洋

(湖南省疾病預防控制中心，湖南 長沙 410003)

抗病毒藥是一類用于預防和治療病毒感染的藥物[1]，可用于治療流感，以及廣譜病毒感染如艾滋病、皰疹、肝炎等[2-5]。這些藥物最終會以原型或者代謝產(chǎn)物形式通過尿液或糞便排出體外，隨著生活污水、醫(yī)療廢水等排放進入污水處理系統(tǒng)[6-9]。然而，目前的污水處理系統(tǒng)只能去除部分藥物[10]，對大多數(shù)藥物的去除效果不佳，有的幾乎未被去除[11]。而未被處理的藥物會隨著污水處理廠出水的排放再次進入環(huán)境水體甚至飲用水，造成污染。Peng等[12]在珠江三角洲的污水處理廠及地表水中檢出阿昔洛韋，質(zhì)量濃度分別為177～406 ng/L和114～205 ng/L。

Sanderson等[13]對典型水生生物(藻類、水蚤和魚)的毒性預測結果顯示，抗病毒類藥物位列最具毒性的藥物第8位；Schlüter-Vorberg 等[14]的研究證實，阿昔洛韋及其臭氧氧化產(chǎn)物可分別對大型蚤和綠藻產(chǎn)生明顯的慢性毒理作用。另外，野生鳥類對抗病毒藥物已產(chǎn)生耐藥性[15]。因此，考察和了解環(huán)境中抗病毒類藥物的存在水平和生態(tài)效應具有較強的科學意義。

目前有關環(huán)境水體中抗病毒藥物的分析方法報道較少，已有報道主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-12]，該方法特異性強、靈敏度高，是現(xiàn)階段痕量分析中最主要的技術手段，Prasse等[11]采用固相萃取柱凈化和液相色譜-質(zhì)譜法(SPE/LC-MS/MS)對廢水、河水及地下水中阿昔洛韋等10種抗病毒藥物進行了分析，取得了較好的效果。但目前有關抗病毒藥物更昔洛韋、恩替卡韋、替比夫定及金剛烷胺在環(huán)境水體中存在水平的研究尚未見報道。本研究選擇伐昔洛韋、阿巴卡韋、恩替卡韋、齊多夫定、奈偉拉平、更昔洛韋、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韋和金剛烷胺10種抗病毒類藥物為對象物質(zhì)，利用固相萃取富集凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術建立了地表水中10種抗病毒藥物的分析方法，并應用于實際樣品的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITYTM超高效液相色譜-Xevo?-TQ-S質(zhì)譜儀(美國 Waters公司)、MassLynx V4.1工作站。Oasis HLB(500 mg，6 mL)、Oasis MCX(500 mg，6 mL)固相萃取柱(美國Waters 公司)；ISOLUTE ENV+(500 mg，6 mL)固相萃取柱(瑞典Biotage 公司)；GF/A玻璃纖維濾紙(美國Whatman公司);甲醇、乙腈(HPLC級，Dikma公司)；甲酸(HPLC級，F(xiàn)luka公司)；氨水、鹽酸(分析純，國藥集團北京化學試劑公司)。伐昔洛韋、阿巴卡韋、恩替卡韋、齊多夫定、奈偉拉平、更昔洛韋、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韋、金剛烷胺標準品(純度均≥99%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取伐昔洛韋、阿巴卡韋、恩替卡韋、齊多夫定、奈偉拉平、更昔洛韋、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韋和金剛烷胺對照品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別精密量取上述各成分的對照品儲備液適量，用甲醇分別制成混合標準溶液和標準中間溶液，避光于-18 ℃保存。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1液相色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；樣品溫度：4 ℃；進樣體積：10 μL。流動相：A為0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1 min，99%A；1～2 min，99%～95%A;2～3 min，95%～70%A；3～5 min，70%～5%A；5～5.5 min，5%A；5.5～5.6 min，5%～99%A。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧電離，正離子模式(ESI+)；質(zhì)譜掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓：0.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；碰撞室壓力：3.1×10-3mbar。10種抗病毒藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 10種抗病毒藥物的UPLC-MS/MS檢測條件Table 1 UPLC-MS/MS acquisition parameters for antiviral drugs

(續(xù)表1)

CompoundRetention time/minMRM-transitions(m/z)Cone voltage/VCollision energy/eVAcyclovir(阿昔洛韋)2.23226.1>152.1*,226.1>135.13512,28Amantadine(金剛烷胺)3.86152.1>135.1*,152.1>93.13518,26

*quantitative ion

1.4 樣品前處理

地表水樣品于2017年4月5日取自湘江長沙段。水樣經(jīng)GF/A(0.45 μm)玻璃微纖維濾紙過濾，4 ℃保存，在24 h內(nèi)進行處理。

取1 000 mL水樣調(diào)至pH 7.0，以5～10 mL/min的速度通過預先用2 mL正己烷、2 mL丙酮、6 mL甲醇和6 mL超純水活化的ISOLUTE ENV+固相萃取柱。上樣完畢后，將小柱減壓抽干，用6 mL甲醇-丙酮溶液(體積比50∶50，含0.2%甲酸)洗脫，洗脫液在微弱的氮氣流下吹干，然后用甲醇-水(體積比50∶50)溶液定容至1.0 mL，渦旋混合1 min，于4 ℃以10 000 r/min離心10 min，取上清液用于UPLC-MS/MS測定。

2 結果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于MRM技術具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點，因此，為實現(xiàn)對環(huán)境中目標化合物的痕量分析，本實驗采用MRM進行檢測。首先，在流動注射狀態(tài)下，分別將0.1 mg/L的10種抗病毒藥物的單標溶液在正離子和負離子模式下進行全掃描以選擇適當?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結果表明：在正離子全掃描模式下，[M+H]+為最強峰，以其為準分子離子進行碰撞誘導解離，并對毛細管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化。

在流動相中加入少量甲酸能增加化合物在正離子檢測模式下的電離效率，促進[M+H]+離子生成，因此正離子檢測模式下測定的目標組分采用0.1%甲酸水溶液和乙腈作流動相，優(yōu)化梯度洗脫條件。依據(jù)目標化合物的理化性質(zhì)，比較了待測物在ACQUITY UPLC BEH C18、HSS T3及CORTECS C18色譜柱上的分離效果。結果顯示，恩替卡韋、齊多夫定、奈韋拉平、更昔洛韋和替比夫定在BEH C18和CORTECS C18柱的響應和峰形比HSS T3柱好，且伐昔洛韋在BEH C18上的響應遠高于CORTECS C18柱，因此實驗最終選擇BEH C18作為色譜分析柱。圖1為質(zhì)量濃度為5.0 μg/L 的10種抗病毒藥物標準溶液的MRM色譜圖。

2.2 固相萃取柱的選擇

本實驗采用固相萃取技術對水體中目標化合物進行富集和凈化，選擇反相固相萃取小柱Oasis HLB、ISOLUTE ENV+和陽離子交換小柱Oasis MCX進行比較，用加標為2 ng/L的1 000 mL超純水溶液(pH值分別為2.0、4.0、7.0和10.0)評價其回收率。結果表明：10種目標物在HLB柱的回收率均低于50%，伐昔洛韋、齊多夫定、拉米夫定、阿昔洛韋和金剛烷胺的回收率低于10%，上樣液pH值的變化對該結果影響不明顯，這可能是因為目標物的極性過強，在反相HLB上保留弱所致；在MCX柱上，伐昔洛韋和阿巴卡韋的回收率分別為29%和21%，其他8種抗病毒藥物的回收率均在50%以上，且pH 4.0時效果最佳；使用ISOLUTE ENV+柱時，目標組分的回收率為73.0%～119.0%，且pH 7.0時回收率最高，與文獻研究結果基本一致[11]。這是因為ISOLUTE ENV+柱是一種超交聯(lián)羥基聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物，利于從大量水樣中吸附極性化合物。因此，實驗最終選擇ISOLUTE ENV+用于水樣的富集凈化(pH 7.0)。

2.3 線性范圍與定量下限

根據(jù)10種抗病毒藥物在質(zhì)譜中響應的強弱配制不同濃度的系列標準溶液，在處理過的湘江水中加入不同濃度的標準溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/L的系列混合標準溶液，按“1.4”方法進行富集測定，分別以其峰面積(Y)對相應質(zhì)量濃度(X，ng/L)進行線性回歸分析，得10種目標物的相關系數(shù)r2>0.993，結合整個方法的富集倍數(shù)和回收率計算出該方法對地表水中目標化合物的定量下限(S/N=10)為0.2～5.0 ng/L(表2)。

2.4 回收率與精密度

取湘江水源水(總有機碳(TOC)為2.178 mg/L，pH 7.2 )加入適量的混合標準溶液，使目標化合物質(zhì)量濃度分別為2、5、10 ng/L，按最優(yōu)條件進行處理和測定(表2)，得到平均加標回收率為70.0%～104.0%，相對標準偏差(RSD)小于15%。方法的回收率與精密度可滿足環(huán)境樣品中痕量污染物的分析要求。

表2 地表水中10種抗病毒藥物的線性范圍、相關系數(shù)、定量下限、加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r2),limits of quantitation(LOQs),recoveries and RSDs of 10 antiviral compounds in surface water(n=6)

2.5 實際樣品的測定

采用本方法對湘江長沙某段水源水3次采樣樣品進行檢測，均檢出阿昔洛韋、更昔洛韋和奈韋拉平(圖2)，質(zhì)量濃度分別為0.25～1.25、0.58～2.46、0.27～0.76 ng/L，阿昔洛韋的檢測結果與Peng等[12]對珠江水的報道結果基本一致。實際樣品中檢出更昔洛韋和奈韋拉平可能與不同地區(qū)抗病毒藥物的消費使用情況不同有關。

3 結 論

本研究采用ISOLUTE ENV+固相萃取柱濃縮凈化和LC-MS/MS技術建立了同時檢測地表水中10種常用抗病毒藥物的分析方法，回收率和精密度均符合環(huán)境水樣中痕量污染物的分析要求。采用該方法對湘江水源水進行檢測，檢出阿昔洛韋、更昔洛韋和奈韋拉平3種藥物。考慮到抗病毒藥物的潛在毒性效應，應對此類藥物在醫(yī)療廢水及自然水體中的污染狀況和環(huán)境行為做進一步研究。