氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰兒奶粉中16種鄰苯二甲酸酯類化合物

許兵兵, 李曉敏, 張慶合, 朱維晃

(1. 西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院, 陜西 西安 710055; 2. 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所, 北京 100029)

鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalate acid esters, PAEs)是一類有機(jī)污染物的總稱,常應(yīng)用在塑料制品中以提高產(chǎn)品韌性[1]。PAEs與基體之間不是以共價(jià)鍵的形式存在[2],所以PAEs很容易遷移入空氣[3]、水[4]和土壤[5]等外界環(huán)境介質(zhì)中。研究表明，PAEs是一類內(nèi)分泌干擾物,產(chǎn)生和雌激素相似的作用,一些PAEs具有致癌特性[6,7]。其中,鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)根據(jù)其致癌程度被歸為2B類[8]。因此,美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(US EPA)將PAEs列為優(yōu)先控制污染物;歐盟食品安全局(EFSA)規(guī)定鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)和DEHP的每日最大攝入量分別為0.01、0.5和0.05 mg/kg[9-11]。

表 1 16種塑化劑的名稱和性質(zhì)Table 1 Compound names and properties of the 16 phthalate acid esters (PAEs)

Kow: octanol/water partition coefficient; bp: boiling point.

歐洲、美國(guó)、加拿大和亞洲的嬰兒奶粉中均曾檢出部分鄰苯二甲酸酯類塑化劑成分,其中DEHP和DBP分別為34～281 μg/kg和15～77 μg/kg[12]。Fiernes等[13]在比利時(shí)農(nóng)場(chǎng)中亦發(fā)現(xiàn)8種常見PAEs,其中DEHP含量最高,為201.3～499.7 μg/kg。Lin等[14]發(fā)現(xiàn)塑料蓋包裝奶粉塑化劑含量高于金屬和玻璃蓋包裝。嬰兒奶粉中的塑化劑引入主要存在于兩個(gè)環(huán)節(jié):其一是水源,土壤以及牧草的塑化劑污染引入到鮮奶原料中[15];其二在奶粉的制作過程,比如采集奶源的聚氯乙烯(PVC)管、儲(chǔ)備罐等因?yàn)樗芑瘎┑挠H油脂特性產(chǎn)生遷移[16]。

嬰兒配方奶粉作為嬰兒主要能量和營(yíng)養(yǎng)來源,基體成分復(fù)雜,主要含有脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物,還具有少量維生素、礦物質(zhì)和核苷酸等成分[17]。因此,其中塑化劑的檢測(cè)難度較大。乳品基體中塑化劑的相關(guān)檢測(cè)方法以外標(biāo)法為主,多采用液液萃取-固相萃取凈化結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)少數(shù)成分[18]。Yue等[19]使用反向遷移硅膠富集乳品中的PAEs成分;Farajzade等[20]通過液液微萃取濃縮PAEs,提高檢出限;Miclean等[21]將頂空固相微萃取應(yīng)用于測(cè)定盒裝奶中6種PAEs,縮減了前處理步驟。但是外標(biāo)法無法滿足更多PAEs組分的檢測(cè)要求,檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較差。近年有文獻(xiàn)[22,23]報(bào)道以同位素內(nèi)標(biāo)法結(jié)合液液萃取-固相萃取前處理,采用液相色譜-質(zhì)譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中17種PAEs成分,與外標(biāo)法相比,內(nèi)標(biāo)法可以克服前處理環(huán)節(jié)的不足,應(yīng)用于更多種PAEs的測(cè)定,但回收率和精密度仍不理想,主要因?yàn)閶雰耗谭刍w復(fù)雜,影響方法準(zhǔn)確性。本研究嘗試比較氧化鋁/乙二胺-N-丙基硅烷(alumina/PSA)和PSA兩種不同玻璃固相萃取柱對(duì)16種PAEs(見表1)的凈化效果,探求奶粉基體樣品前處理中PAEs測(cè)定的影響因素,尋求測(cè)定嬰兒奶粉基體中PAEs的準(zhǔn)確可靠的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7000B三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀和Agilent DB-5 MS UI氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(美國(guó)Agilent公司); N-EVAP 111氮吹儀,配有OASYSS水浴加熱裝置(美國(guó)Organomation公司); ME614S、ME36S天平(德國(guó)Sartorius公司); D-7700 Singen Transsonic Digitals超聲器(德國(guó)Elma公司); CR 21GⅢ高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司); MX-S渦旋混合器(美國(guó)Scilogex公司);玻璃具塞離心管(15 mL),玻璃移液管(10 mL和1 mL), 24管固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司); 氧化鋁/PSA混合玻璃固相萃取柱(3 g/6 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司), PSA玻璃固相萃取柱(1 g/6 mL,北京迪科馬科技有限公司)。

氯化鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;色譜級(jí)乙酸乙酯、二氯甲烷和質(zhì)譜級(jí)乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher公司;色譜級(jí)正己烷購(gòu)自德國(guó)Merck公司;丙酮購(gòu)自美國(guó)Baker公司;鄰苯二甲酸酯二壬酯(DNP)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Chemservice公司,鄰苯二甲酸二丁酯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10134)購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,其余14種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstofer公司,純度范圍98.0% ～99.9% 。16種氘代塑化劑內(nèi)標(biāo)(PAEs-D4)的正己烷溶液的質(zhì)量濃度為100 μg/mL,購(gòu)自北京迪科馬科技有限公司。

1.2 校準(zhǔn)溶液的配制

16種PAEs純品用甲醇配制成100 μg/g標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及50 μg/g工作溶液。

16種氘代內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)用乙醇稀釋,配制成50 μg/g工作溶液。均于4 ℃保存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取奶粉樣品0.5 g(精確至0.000 1 g)于15 mL玻璃離心管中,加入3 mL去離子水,渦旋振蕩30 s混合均勻,然后加入6 mL乙腈和1.0 g的NaCl后再渦旋振蕩2 min。在20 ℃、3 000 r/min條件下離心5 min后取上清液,于40 ℃下用氮?dú)獯蹈珊?加3 mL正己烷復(fù)溶,待凈化。

PSA玻璃固相萃取柱使用5 mL丙酮和5 mL正己烷活化,將上述待凈化液上樣,再依次使用5 mL正己烷和5 mL正己烷-丙酮(60∶40, v/v)進(jìn)行洗脫,流速控制為1 mL/min,收集兩次洗脫液于同一離心管中,在40 ℃的水浴中用氮?dú)獯蹈?加入1 mL二氯甲烷復(fù)溶后以GC-MS/MS測(cè)定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Agilent DB-5MS UI(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:50 ℃保持1 min,以20 ℃/min升溫至230 ℃,保持1 min,再以3 ℃/min升溫至240 ℃,保持1 min,然后以5 ℃/min升溫至300 ℃并保持10 min;載氣:氦氣,純度≥99.999% ;柱流速:1 mL/min,恒流;進(jìn)樣體積:1 μL;進(jìn)樣口溫度:300 ℃;進(jìn)樣模式:不分流進(jìn)樣。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電子轟擊離子(EI)源;離子源溫度:280 ℃;四極桿溫度:150 ℃; GC-MS/MS傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲:5 min;碰撞氣(N2)流速:1.5 mL/min,淬滅氣(He)流速:2.25 mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,每個(gè)塑化劑選取2個(gè)特征MRM反應(yīng),一個(gè)定量離子對(duì),一個(gè)定性離子對(duì);每種塑化劑內(nèi)標(biāo)僅提供定量離子對(duì)信息(見表2)。

表 2 16種PAEs及PAEs-D4三重四極桿質(zhì)譜MRM條件參數(shù)Table 2 MRM parameters of 16 PAEs and corresponding PAEs-D4

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

圖 1 不同體積乙腈對(duì)嬰兒奶粉中16種塑化劑提取效率的 影響(n=5)Fig. 1 Effect of extraction volume of acetonitrile on the extraction rates of the 16 PAEs in infant formula (n=5) Extraction conditions: sample mass, 0.5 g; water volume, 3 mL; salt addition, 1.0 g NaCl.

1.5 同位素內(nèi)標(biāo)法計(jì)算

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量PAEs和PAEs-D4工作溶液加入空白基質(zhì)溶液中,配制成16種PAEs分別為0.01～2.0 mg/kg的5個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)溶液。以PAEs的含量為橫坐標(biāo)X(mg/kg),目標(biāo)物定量離子對(duì)峰面積與其對(duì)應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)定量離子對(duì)峰面積之比為縱坐標(biāo)Y,進(jìn)行線性回歸,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑用量的選擇

食品基體中塑化劑提取常用溶劑有正己烷和乙腈[24],但是正己烷對(duì)乳品進(jìn)行提取會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,而乙腈既可以作為蛋白質(zhì)沉淀劑亦是提取溶劑,鹽析作用下可與水相形成穩(wěn)定分層,便于提取。因此,選擇乙腈作為提取溶劑。對(duì)乙腈的提取用量及乙腈提取的效率進(jìn)行了比較研究(見圖1)。

4、6和9 mL乙腈的提取效率隨著乙腈體積的增加先增加后降低,6 mL時(shí)的提取效率最優(yōu)。說明小體積的提取溶劑不能充分提取PAEs,但是受離心管容量限制,大體積的乙腈與基體的混合不充分,也會(huì)導(dǎo)致提取效率偏低。16種PAEs的提取效率為22.6% ～83.7% , RSD為1.8% ～7.1% 。DEHP、DNOP和DNP的提取效率為22.6% ～43.3% ,其他13種PAEs為65.5% ～82.6% 。由于乙腈極性中等,高lgKow的弱極性PAEs更易于分配到脂肪中,所以提取效率偏低。Li等[25]亦報(bào)道了類似的結(jié)果,使用乙腈提取原乳中9種PAEs,平均回收率為65.2% ～98.3% ,提取效率隨著PAEs極性的減小而降低,說明乳品中脂肪的存在對(duì)于乙腈提取低極性PAEs的效率影響很大。若采用弱極性溶劑提高低極性PAEs的提取效率,脂肪共提取情況無法避免。Ren等[23]使用弱極性溶劑正己烷提取3種不同乳品基體,不僅出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,而且3種基體中強(qiáng)極性塑化劑DMP和DEP的提取效率僅為17.4% ～51.8% 。為了減小干擾和簡(jiǎn)化操作,本文使用6 mL乙腈作為提取溶劑。

圖 2 氧化鋁/PSA固相萃取柱上不同洗脫溶劑對(duì)16種塑化劑回收率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of different elution solvents on the recoveries of the 16 PAEs on alumina/PSA SPE column (n=5)

2.1.2固相萃取柱的選擇和洗脫溶劑的優(yōu)化

因?yàn)樗芑瘎z測(cè)的特殊性,需要避免使用塑料制品固相萃取柱。本試驗(yàn)采用不同洗脫溶劑,考察了兩種玻璃固相萃取小柱(氧化鋁/PSA柱和PSA柱)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。

考察氧化鋁/PSA固相萃取柱，該柱有淋洗過程,通過計(jì)算淋洗液穿透率,并未發(fā)現(xiàn)大量PAEs淋洗穿透現(xiàn)象(見表3),隨后對(duì)洗脫溶劑進(jìn)行了優(yōu)化。比較了4組不同體積比的正己烷-乙酸乙酯混合液、2組不同體積比的正己烷-丙酮混合液和丙酮作為洗脫液的洗脫效果(見圖2), 7種不同洗脫液對(duì)DMP和DEP兩種強(qiáng)極性PAEs洗脫效果均不理想,DMP和DEP的回收率范圍分別為2.8% ～57.6%和35.0% ～87.5% 。造成上述結(jié)果的原因可能是氧化鋁作為一種強(qiáng)吸附劑,常用來吸附基體中的極性物質(zhì)[26],強(qiáng)極性PAEs也有較強(qiáng)吸附而難以洗脫,故導(dǎo)致DMP和DEP的回收偏低。夏冰等[27]采用氧化鋁類固相萃取對(duì)17種塑化劑進(jìn)行分析,回收率低于20% 。

考察PSA固相萃取柱，該類型固相萃取柱沒有淋洗過程,直接對(duì)洗脫溶劑進(jìn)行優(yōu)化。比較了3組不同體積比的正己烷-丙酮混合液、1組正己烷-乙酸乙酯混合液和乙腈的洗脫效果(見圖3)。在正己烷-丙酮(96∶4, v/v)混合液洗脫條件下,16種PAEs的回收率為21.4% ～112.6% ,其中極性較大的DMEP、DEEP和DPhP的回收率分別為23.6% 、42.3%和21.4% 。隨著丙酮體積比從4%上升至40% ,強(qiáng)極性塑化劑的回收率明顯提升,采用正己烷-丙酮(60∶40, v/v)混合液洗脫時(shí)效果最優(yōu),16種PAEs的回收率為79.1% ～120.1% ,且絕大多數(shù)PAEs回收率近100% 。正己烷-乙酸乙酯(50∶50, v/v)混合液和乙腈洗脫時(shí)的回收率分別為16.2% ～118.0%和54.3% ～100.6% 。正己烷-乙酸乙酯(50∶50, v/v)混合液與正己烷-丙酮(60∶40, v/v)混合液相比，極性偏小,所以很難將強(qiáng)極性PAEs洗脫下來,DPhP的回收率只有16.2% 。乙腈的極性偏大,對(duì)弱極性PAEs洗脫不完全,絕大多數(shù)PAEs的回收率低于80% 。PSA填料小柱可去除極性化合物,如碳水化合物、色素、有機(jī)酸類物質(zhì),該類型的柱子在塑化劑檢測(cè)中有較多應(yīng)用,如植物飲料[27]和食用油[28]基體PAEs的凈化,同種類的PSA固相萃取柱的回收率范圍是78.9% ～98.7%[27]。

表 3 氧化鋁/PSA固相萃取柱對(duì)16種塑化劑的淋洗穿透率評(píng)估Table 3 Evaluation of the penetration of 16 PAEs onalumina/primary secondary amine (PSA) SPE column

圖 3 PSA固相萃取柱上不同洗脫溶劑對(duì)16種塑化劑回收率的影響(n=5)Fig. 3 Effect of different elution solvents on the recoveries of the 16 PAEs on PSA SPE column (n=5)

表 4 50 μg/kg水平下外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法的回收率(n=5)Table 4 Recoveries of external and internal methods at 50 μg/kg spiked level (n=5)

考察了兩種不同類型固相萃取柱。氧化鋁/PSA混合柱采用7種洗脫液洗脫,除強(qiáng)極性的DMP和DEP回收率偏低,大多數(shù)PAEs的回收率超過120% ,說明該類型固相萃取柱基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng),不適合奶粉基質(zhì)的PAEs分析。而PSA固相萃取柱以正己烷-丙酮混合液(60∶40, v/v)作為洗脫溶劑,16種PAEs的回收率較優(yōu),作為本實(shí)驗(yàn)的最終凈化條件。

2.2 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量結(jié)果的對(duì)比

在50、250、500和1 000 μg/kg 4個(gè)水平進(jìn)行回收率和重復(fù)性試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)5次。4個(gè)水平上外標(biāo)法測(cè)定的回收率和RSD分別為20.1% ～85.6%和1.1% ～5.3% ,弱極性PAEs回收效果較差。4個(gè)加標(biāo)水平上同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定的回收率和RSD分別為96.1% ～104.0%和0.7% ～3.3% 。

以加標(biāo)水平為50 μg/kg時(shí)的兩種定量方法進(jìn)行對(duì)比(見表4)。外標(biāo)法中DEHP、DNOP和DNP的回收率偏低,為20.1% ～40.4% ,其他13種PAEs的平均加標(biāo)回收率為63.7% ～82.2% , RSD小于5.3% 。而同位素內(nèi)標(biāo)法中16種PAEs的回收率則為96.1% ～104.0% , RSD小于3.3% 。相比于外標(biāo)法,內(nèi)標(biāo)法的方法回收率和精密度明顯提高。

本課題組[29]曾比較白酒中16種PAEs的定量方法,外標(biāo)法回收率80.8% ～128.6% , RSD<12.9% ;內(nèi)標(biāo)法回收率94.3% ～105.3% , RSD<6.5% 。內(nèi)標(biāo)法回收率和精密度均有提高,與本文內(nèi)容一致。對(duì)于復(fù)雜基體而言,外標(biāo)法會(huì)因?yàn)榍疤幚磉^程或基質(zhì)效應(yīng)而出現(xiàn)定值不準(zhǔn)的情況,而同位素內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)物性質(zhì)相似,可以最大程度消除前處理過程和基質(zhì)效應(yīng)引入的誤差,提高定量的準(zhǔn)確性。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,以空白嬰兒奶粉基體匹配液配制5個(gè)不同水平的校準(zhǔn)溶液。結(jié)果如表5所示,0.01～2.0 mg/kg范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。以信噪比(S/N)分別為3和10確定檢出限和定量限分別是0.15～2.50 μg/kg和0.50～8.33 μg/kg。相比于文獻(xiàn)[30]檢測(cè)奶粉樣品的檢出限12.91～126.05 μg/kg,提升15～25倍。Ren等[23]同樣以同位素內(nèi)標(biāo)定量嬰兒奶粉中PAEs, 16種PAEs的定量限為15～30 μg/kg,與之相比本方法提高了7倍以上,食品中嚴(yán)格限量的DBP的定量限提升了20倍。

表 5 16種PAEs的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2), the limits of detection (LODs) and the limits of quantification (LOQs) of the 16 PAEs

Y: peak area ratio of PAE to PAE-D4;X: content, mg/kg.

圖 4 (a)空白嬰兒奶粉樣品經(jīng)PSA柱凈化后的全掃模式 色譜圖和(b)16種塑化劑空白奶粉基質(zhì)匹配校準(zhǔn)液(200 μg/L)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式色譜圖 Fig. 4 Chromatograms of (a) the blank infant formula sample purified by PSA column under scan mode and (b) 16 PAEs of the blank matrix-matched standard (200 mg/L) under MRM mode Peak Nos. are the same as those in Table 1.

2.4 固相萃取柱凈化效果分析

嬰兒奶粉基體成分復(fù)雜,不可避免在液液萃取環(huán)節(jié)出現(xiàn)干擾物共提取的情況,同時(shí)固相萃取柱也很難將不同特性干擾物一同去除。在樣品GC-MS/MS檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn),新襯管進(jìn)樣150次左右會(huì)出現(xiàn)峰形拖尾和響應(yīng)降低的現(xiàn)象,說明樣品因成分復(fù)雜未被充分凈化,存在雜質(zhì)污染色譜柱柱頭。使用全掃描模式對(duì)空白奶粉樣品進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)25 min后有大量低極性和高沸點(diǎn)的雜質(zhì)出峰(見圖4a)。說明PSA固相萃取柱可以去除一定極性的脂肪酸和色素,但是對(duì)極性較弱的共提取物的去除效果并不理想。雖然這些干擾物出峰時(shí)間晚于16種PAEs,通過三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式可以很好地去除干擾,對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)并沒有太大影響(見圖4b)。但是大量未被凈化的高沸點(diǎn)和弱極性雜質(zhì)進(jìn)入進(jìn)樣口和色譜柱,除了會(huì)對(duì)進(jìn)樣口和色譜柱頭造成污染,長(zhǎng)期積累也會(huì)危害質(zhì)譜系統(tǒng),這就需要定期更換進(jìn)樣口襯管,清洗離子源。若想從根本上解決干擾物污染的問題,需要能夠特異性吸附目標(biāo)物且有效去除干擾物的固相萃取柱,這就對(duì)固相萃取柱填料的要求較高。分子印跡技術(shù)可作為一種選擇,該技術(shù)可以很好地吸附目標(biāo)物達(dá)到基體凈化的目的[31,32],但是因?yàn)榧夹g(shù)的限制,一般對(duì)于單一物質(zhì)的吸附有良好效果,尚未有文獻(xiàn)將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于多組分的PAEs。另一種則是石墨化炭黑(GCB),該類型的填料在農(nóng)藥殘留測(cè)定中應(yīng)用較多,根據(jù)文獻(xiàn)[33],該類型的固相萃取柱可以吸收具有平面苯環(huán)結(jié)構(gòu)的分析物,因此應(yīng)該可以應(yīng)用在嬰兒奶粉復(fù)雜基體中特異性吸附含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的PAEs而達(dá)到凈化目的。但是商品化的GCB填料固相萃取柱沒有玻璃柱類型,自行裝填難度較大,本文暫未驗(yàn)證其凈化效果。

3 總結(jié)

本文建立了一種液液萃取-固相萃取凈化測(cè)定嬰兒奶粉中16種鄰苯二甲酸酯類塑化劑殘留的方法。采用乙腈作為提取溶劑,其中低極性塑化劑提取效率偏低,但是同位素內(nèi)標(biāo)法可以彌補(bǔ)低極性塑化劑提取效率偏低的不足。與外標(biāo)法相比,精密度和穩(wěn)定性更好,可以達(dá)到更準(zhǔn)確的定量要求。以PSA填料固相萃取柱凈化,可以較好地去除其中有極性的脂肪酸、有機(jī)酸、糖類和色素,但是對(duì)于一起被提取出來的低極性、高沸點(diǎn)雜質(zhì)的去除效果并不理想。雖然三重四極桿質(zhì)譜的MRM模式可以很好地去除干擾,但進(jìn)樣口、色譜柱和質(zhì)譜還是會(huì)受到污染,影響塑化劑的響應(yīng)。這也反映了嬰兒奶粉基體復(fù)雜,需要更加理想的固相萃取柱將其中所有的干擾物去除。