固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定牛奶和羊奶中莫奈太爾及其代謝產物殘留

吳映璇, 謝敏玲, 姚仰勛, 藍 草

(廣東檢驗檢疫技術中心, 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室, 廣東 廣州 510623)

牛奶和羊奶,因其較高的營養(yǎng)價值備受消費者青睞,同樣其安全問題也引起了人們的普遍關注,特別是獸藥殘留問題[1-5]。奶中的獸藥殘留主要是由于產奶動物使用獸藥后,獸藥或其代謝物進入生乳中并由此對消費者帶來健康隱患。氨基乙腈衍生物莫奈太爾是一種新型的驅蟲藥,可以有效殺滅耐受其他類別藥物的線蟲[6]。國外已有大量研究表明該藥具有良好的抗蟲效果、毒性低且不容易產生耐藥性,在寄生蟲感染防治方面具有很廣闊的應用前景[7-12],同時也制定了最大殘留限量。歐盟37/2010規(guī)定:牛奶和羊奶中莫奈太爾的標志殘留物為莫奈太爾砜,最大殘留限量為0.17 mg/kg[13]。澳大利亞農獸藥局發(fā)布2017年第3號公報,擬修訂《澳新食品標準法典》附表20,對牛奶中莫奈太爾殘留限量規(guī)定為0.05 mg/kg[14]。我國尚未制定出最大殘留限量。研究發(fā)現(xiàn),莫奈太爾經口給藥后,在動物體內被吸收并快速氧化為亞砜,亞砜又進一步氧化為砜[6]。因此,建立有效的莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的檢測方法,可為牛奶和羊奶中莫奈太爾的代謝研究提供有效可行的檢測方法,為研究養(yǎng)殖過程中產奶動物用藥后3種藥物在牛奶和羊奶中的分布情況提供技術支撐,為制定國內牛奶和羊奶中莫奈太爾的最大殘留限量提供基礎數據,對有效控制牛奶和羊奶產品中莫奈太爾的殘留,促進畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,保障廣大人民群眾的身體健康,具有深遠的意義。

Kinsella等[15]測定了牛奶和綿羊肌肉中莫奈太爾和莫奈太爾砜,樣品提取后需要兩次凈化處理,采用內標法定量,但所采用的內標并不是其對應的同位素內標,在色譜分離過程中,保留時間相差至少1 min以上,兩者之間的色譜和質譜行為差異大,未能補償莫奈太爾和莫奈太爾砜由于基質效應的影響引起的響應信號的改變,未能起到同位素內標的校正作用。本工作在前人研究的基礎上以牛奶和羊奶為樣品基質,采用稀釋的方法,減少了負載在色譜柱上的基質,從而減弱了基質效應。采用基質標準曲線校正定量結果,減少基質效應的同時降低了前處理成本,采用高效液相色譜-三重四極桿質譜(HPLC-MS/MS)結合固相萃取(SPE)凈化等技術,建立了牛奶和羊奶中莫奈太爾及其代謝產物殘留量的檢測方法。該方法操作簡便,前處理成本低,靈敏度高,抗干擾能力強,定性定量準確,彌補了國內牛奶和羊奶中莫奈太爾及其代謝產物檢測方法的空白,為我國建立莫奈太爾最大殘留限量提供數據支持與技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UFLC LC-20A DXR高效液相色譜儀(日本島津公司); API 4000 QTRAP三重四極桿串聯(lián)質譜儀,配ESI離子源(美國Sciex公司);Turbovap LV吹氮濃縮儀(美國Zymark公司);渦旋振蕩器(德國IKA公司);超純水機(美國Millipore公司)。

莫奈太爾(純度>99.0% )、莫奈太爾亞砜(純度>99.0% )和莫奈太爾砜(純度>99.2% )標準品(美國Witega公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國Tedia公司);乙酸銨(優(yōu)級純,印度Fluka公司);去離子水由Millipore公司超純水機制得;中性氧化鋁SPE柱(1 g/3 mL,美國色譜科公司),用3 mL乙腈活化,備用。

定容液:量取90 mL甲醇和10 mL 0.5 mmol/L乙酸銨溶液,混合,搖勻備用。

1.2 樣品前處理

取市售具有代表性的羊奶(牛奶)樣品500 mL,混合均勻,密封并標明標記,于4 ℃保存。

稱取2 g樣品(精確至0.01 g)至50 mL的離心管中,加入18 mL乙腈,渦旋振蕩10 min, 4 000 r/min離心5 min,上清液轉移至25 mL帶刻度比色管中,用乙腈定容至刻度,搖勻,備用。吸取2.5 mL樣品提取液過中性氧化鋁SPE柱(用3 mL乙腈預活化),收集流出液,再用2 mL乙腈淋洗SPE柱,合并收集的流出液至10 mL試管中,在50 ℃水浴中氮吹濃縮至干。殘渣用2.0 mL甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨(9∶1, v/v)溶解,渦旋振蕩1 min,超聲3 min,經0.2 μm濾膜過濾后,供HPLC-MS/MS測定。

1.3 色譜條件

Inertsil C8-3色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,日本島津公司);流速:0.80 mL/min;流動相:A:甲醇;B:0.5 mmol/L乙酸銨溶液;梯度洗脫:0～3 min, 10%A～95%A;3～5 min,95%A;5～5.1 min,95%A～10%A;5.1～10 min,10%A。柱溫:40 ℃;進樣量:5 μL。

1.4 質譜條件

離子源:ESI源,負離子模式;離子源溫度:400 ℃;噴霧電壓:-4 500 V;氣簾氣壓力:207 kPa;霧化氣壓力:414 kPa;輔助加熱氣壓力:483 kPa;碰撞氣壓力:76 kPa;待測物的其他參數見表1。

表 1 莫奈太爾及其代謝產物的保留時間、母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量Table 1 Retention times, precursor ions, product ions, declustering potentials and collision energies of monepantel and its metabolites

* Quantitative ion.

2 結果與分析

2.1 凈化條件的優(yōu)化

由于牛奶和羊奶中含有大量的蛋白質以及非極性磷脂類干擾物,容易形成基質干擾,因此必須對其進行凈化處理,以達到減少基質效應的效果。凈化的方式主要有液液分配和SPE兩種方式[16,17]。本研究以羊奶為樣品基質,分別比較了Prime HLB (3 mL/6 mg,美國沃特世公司)、中性氧化鋁和HLB (3 mL/6 mg,美國沃特世公司) 3種SPE小柱的凈化方式。結果顯示,HLB小柱凈化效果最差,各藥物的回收率為44.2% ～57.9% ;采用Prime HLB小柱凈化時各藥物的回收率為75.0% ～83.9% ,中性氧化鋁小柱凈化效果最佳,各藥物的回收率均高于90.1% 。因此,本研究采用中性氧化鋁SPE小柱的通過式凈化方式,凈化效果佳,樣品分析通量高,操作快速,同時保證了較高的回收率。此外,將提取液上柱后,分別采用0、1、2、3、4 mL乙腈進行淋洗。結果發(fā)現(xiàn),采用2 mL乙腈比0 mL淋洗的回收率提高了3.9% ～9.7% ,淋洗體積繼續(xù)增加,各藥物的回收率沒有明顯變化。為避免SPE小柱上吸附的雜質被洗脫下來和減少后續(xù)實驗時間,淋洗體積選擇2 mL。空白羊奶樣品及空白羊奶加標樣品(添加水平2.0 μg/kg)的多反應監(jiān)測色譜圖見圖1,可以看出,凈化效果良好,無干擾。

2.2 定容液的優(yōu)化

液相色譜-質譜聯(lián)用分析一般采用流動相定容,因此本研究比較了不同比例的甲醇和0.5 mmol/L乙酸銨溶液定容莫奈太爾及其代謝產物混合標準溶液(25 μg/L)的分析效果。結果顯示,甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨溶液(9∶1, v/v)定容效果最好,能夠將3種藥物完全溶解,且定量離子的峰面積最高。而如果僅使用甲醇定容,可能導致部分目標物在流動相的水相比例較大時在色譜柱內析出,影響色譜柱及質譜壽命。基于此,本研究最終選擇采用9∶1(v/v)的甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨溶液定容檢測。

2.3 色譜柱的選擇

分別考察了Inertsil C8柱、Atlantis Hillic柱(100 mm×3.0 mm，3 μm, 美國沃特世公司)和Atlantis T3柱(100 mm×4.6 mm，3 μm, 美國沃特世公司)對莫奈太爾及其代謝產物進行色譜分離時的峰形和靈敏度。以莫奈太爾亞砜為例,如圖2所示,當Inertsil C8柱作為色譜柱進行色譜分離時,目標物的色譜峰更窄,峰形更尖銳,靈敏度更高,因此選為實驗所用。

圖 1 空白羊奶及羊奶加標樣品(添加水平2.0μg/kg)的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of monepantel and its metabolites in blank sheep milk and sheep milk spiked with standards at 2.0 μg/kg

2.4 質譜條件的優(yōu)化

用蠕動泵以10 μL/min的流速分別連續(xù)注射0.5 mg/L的莫奈太爾及其代謝產物混合標準溶液于ESI離子源中,在負離子檢測模式下進行一級質譜掃描,得到分子離子峰[M+H]+,并對其進行二級質譜掃描,得到莫奈太爾及其代謝產物的二級質譜信息(見圖3)。選取響應強度高、基線噪聲低的兩對離子對作為監(jiān)測離子對,并在MRM模式下優(yōu)化離子對的去簇電壓、碰撞能量等質譜參數。

2.5 基質效應

基質效應在復雜樣品基質的液相色譜-電噴霧質譜聯(lián)用分析中普遍存在,一般認為可能是源于待測組分與樣品中的基質成分在霧滴表面離子化過程的競爭。其結果會降低或增加目標離子的生成效率及離子強度,從而影響測定結果的精密度和準確度,很難甚至不能消除[18]?？疾旎|效應的常用方法有柱后灌注法[19]和測定值比較法[18],本研究采用測定值比較法考察了空白羊奶樣品對莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的基質效應。在所建立的儀器條件下,比較空白基質溶液添加5.0 μg/L莫奈太爾及其代謝產物時的測定值與同濃度的標準溶液測定值的比值,確定基質的增強或抑制效應,實驗結果發(fā)現(xiàn),羊奶樣品基質對莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的基質效應分別為110% 、108%和111% ,具有基質增強效應。為減少牛奶和羊奶樣品基質在定量過程中產生的影響,本研究采用基質標準曲線校正定量結果。

2.6 線性范圍、線性方程和檢出限

用空白基質溶液(不含莫奈太爾及其代謝產物的羊奶樣品)分別配制質量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 μg/L的系列莫奈太爾及其代謝產物的基質匹配溶液,對其進行分析,以莫奈太爾及其代謝產物的峰面積為縱坐標(Y)、對應的質量濃度為橫坐標(X, μg/L)作圖,用最小二乘法進行線性回歸,其線性方程及相關系數(r)見表2。當樣品中的莫奈太爾及其代謝產物濃度超出0.1～5.0 μg/L這一線性范圍時,可適當加大樣品的稀釋倍數。

在本方法測定條件下,以信噪比(S/N)≥ 3時基質標準溶液的濃度乘以方法的稀釋倍數推算出方法檢出限(LOD);選擇空白羊奶樣品,當添加水平為2.0 μg/kg時,信噪比≥10,表明其定量限(LOQ)可達到2.0 μg/kg,檢出限及定量限結果見表2。

圖 2 采用不同色譜柱分析莫奈太爾亞砜的MRM圖Fig. 2 MRM chromatograms of monepantel sulfoxide separated using different columns

圖 3 莫奈太爾及其代謝產物的二級離子質譜圖Fig. 3 MS/MS spectra of monepantel and its metabolites

CompoundLinear equationrLOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)MonepantelY=4.79×103X+1.90×1020.99900.0192.0Monepantel sulfoxideY=7.09×103X+5.73×1020.99860.0172.0Monepantel sulfoneY=4.90×103X+1.91×1020.99790.0232.0

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L. Linear range: 0.1-5.0 μg/L

2.7 回收率和精密度

在空白樣品基質中添加3個水平(2.0、50、100 μg/kg)的標準品進行加標回收試驗,每個添加水平重復6次,結果見表3。結果表明,莫奈太爾及其代謝產物的回收率為90.1% ～103.3% ,相對標準偏差為2.0% ～6.2% ,方法的精密度和準確度能夠滿足定量分析要求。

2.8 實際樣品測定

隨機購買市售的國內外牛奶和羊奶樣品15種,按照本研究建立的檢測方法進行測定,15種樣品中均未檢出莫奈太爾及其代謝產物。

表 3 莫奈太爾及其代謝產物的加標回收率與精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions of monepantel and its metabolites (n=6)

3 結論

本研究采用乙腈沉淀蛋白質、中性氧化鋁SPE柱凈化,建立了同時測定牛奶和羊奶中氨基乙腈衍生物莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法,回收率、精密度和定量限均滿足牛奶和羊奶中氨基乙腈衍生物莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜殘留限量的要求。