螺旋霉素分子印跡磁性納米吸附劑的合成及應用

孫佳佳, 章飛芳, 梁鑫淼

(華東理工大學藥學院, 上海 200237)

大環(huán)內酯類抗生素(macrolide antibiotics, MA)是一類弱堿性的親脂性分子,廣泛用于治療人類和動物的細菌感染以及作為育種行業(yè)的生長促進劑?？股氐臑E用會導致食品中的抗生素殘留,對人體產生不良影響[1]。為保證食物安全和消費者的健康,許多國家都對MA設置了最大殘留限量要求(maximum residue limits, MRLs)[2]。比如歐盟對牛奶中替米考星、紅霉素和螺旋霉素的最大殘留限量分別為50、40和200 μg/kg[3]。

目前,MA的檢測方法主要有毛細管電泳-電化學發(fā)光檢測[4]、高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)[5-8]、高效液相色譜(HPLC)結合蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)[9]或紫外檢測器(UVD)[10]。雖然HPLC-MS檢測靈敏度高、適用范圍廣,但其價格極其昂貴,且日常維護成本高的缺陷限制了該方法的普及。由于多數(shù)HPLC均配置有UVD,利用該配置發(fā)展出相應的方法顯然有助于方法的普及。由于多數(shù)MA缺少特定的生色基團或吸收系數(shù)不高,導致方法檢出限較高,無法用于痕量目標物的測定。有必要通過前處理對目標抗生素進行有效富集。

目前用于處理MA樣品的前處理技術主要是固相萃取(solid phase extraction, SPE),包括其衍生技術,例如分散固相萃取[7]、磁性固相萃取[10]、固相微萃取[11]。在眾多SPE吸附劑中,分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)因為能對目標分析物或其結構類似物進行特異性吸附而受到關注。納米尺寸的MIPs比傳統(tǒng)塊狀聚合物具有更多優(yōu)點,比如模板分子容易去除、傳質阻力小且結合速度快[12]。磁性核殼結構分子印跡納米粒子由一個磁性核和分子印跡聚合物殼組成,通過表面分子印跡技術使結合位點位于材料表面,有助于提高萃取效率[13],并且內部的磁性核還可以在外加磁場作用下實現(xiàn)相分離,消除了傳統(tǒng)SPE方法冗長的處理過程[14],同時可以使用少量吸附劑處理大體積樣品,有利于得到更高的富集倍數(shù)。Pérez等[15]合成油酸鹽功能化的磁性納米粒子,結合LC-MS/MS測定不同來源水樣中的3種MA。Xie等[9]以紅霉素、四環(huán)素及氯霉素為混合模板分子,制備出相應的MIP用于SPE吸附劑,采用HPLC-ELSD對牛奶中的紅霉素、四環(huán)素和氯霉素進行分析。Zheng等[16]以泰勒菌素為虛擬模板,制備出相應的MIP用作SPE吸附劑,建立HPLC-UV方法檢測5種飼料中的替米考星。Song等[17]以泰拉霉素為模板分子,通過沉淀聚合法合成相應的MIP,以分散固相萃取的方式結合LC-MS/MS檢測,同時測定豬肉中的7種MA殘留。這些吸附劑的共同特點是無磁性。因此在萃取后,與溶液的分離仍然依靠過濾方式實現(xiàn)。目前,采用MA為模板分子的分子印跡磁性納米吸附劑鮮有報道。

本文以磁性納米Fe3O4為內核,合成出以螺旋霉素(spiramycin, SPI)為模板分子的核殼型分子印跡磁性納米吸附劑,優(yōu)化其合成條件并將其用于蜂蜜樣品中MA的檢測。

1 實驗部分

1.1 材料和試劑

4種MA標準品包括螺旋霉素(SPI,純度97% )、交沙霉素(josamycin, JOS,純度91.2% )、替米考星(tilmicosin, TIL,純度99% )和酒石酸泰勒菌素(tylosin tartrate, TYL,純度98.9% )(德國Dr. Ehrenstorfer公司);丙烯酸(acrylic acid, AA)、甲基丙烯酸(methacrylic acid, MAA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate, EDMA)(色譜純,上海阿拉丁試劑有限公司);偶氮二異丁腈(2,2′-azobis(2-methylpropionitrile), AIBN,色譜純,百靈威科技有限公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO,分析純,上海麥克林生物科技有限公司);冰乙酸(分析純,上海天蓮化工科技有限公司);聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP,優(yōu)級純,國藥集團化學試劑有限公司);甲醇(色譜純,美國TEDIA公司); Fe3O4顆粒(純度99.5% ,粒徑20 nm,阿達馬斯試劑有限公司);甲醇、無水乙醇、氯化鈉、磷酸、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司)。

1.2 色譜儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀,包括LC-20AD輸液泵、DGU-20A3R在線脫氣機、SIL-20AC自動進樣器、SPD-20A檢測器、LCsolution色譜工作站;XCharge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)(華譜新創(chuàng)科技有限公司); Milli-Q超純水發(fā)生器(美國Millipore公司)提供配制溶液的純水。

1.3 螺旋霉素-分子印跡磁性納米吸附劑的合成

在500 mL圓底燒瓶中加入1 g Fe3O4和200 mL無水乙醇,超聲5 min使其分散均勻,之后加入5 mL AA;混合物在35 ℃、300 r/min的機械攪拌下反應2 h,得到Fe3O4@AA。用去離子水和無水乙醇各清洗3遍,之后置于60 ℃烘箱中干燥12 h備用。

在100 mL圓底燒瓶中加入SPI(0.125 mmol, 105.38 mg), MAA(1.75 mmol, 150 μL)和無水DMSO(40 mL),在30 ℃、500 r/min轉速下磁力攪拌1 h,進行預聚合。然后加入250 mg上述處理得到的Fe3O4@AA,以及EDMA(3.5 mmol, 660 μL)和PVP(100 mg);超聲5 min使混合均勻,然后加入60 mg AIBN;在N2保護條件下,60 ℃、700 r/min轉速下磁力攪拌24 h,進行自由基聚合反應。磁場分離得到固體顆粒,去離子水和乙醇各清洗3次,得到最終的吸附劑Fe3O4@AA@SPI@MIP。其合成路線如圖1所示。

非印跡聚合物Fe3O4@AA@NIP的合成步驟與上述過程一樣,區(qū)別在于無模板分子加入。

使用40 mL 20% (v/v)乙酸-甲醇超聲30 min處理上述Fe3O4@AA@SPI@MIP,重復洗脫3次,取每次洗脫液各7 mL,氮氣吹干后用10% (v/v)甲醇-水重溶至500 μL。經HPLC-UV檢測,后兩次洗脫液中都沒有SPI的紫外吸收,證明模板分子去除干凈。最終將吸附劑在60 ℃烘箱中干燥12 h。

圖 1 Fe3O4@AA@SPI@MIP合成路線示意圖Fig. 1 Schematic diagram of synthesis route of Fe3O4@AA@SPI@MIP

1.4 Fe3O4@AA@SPI@MIP吸附實驗

飽和吸附量的考察:將10 mg Fe3O4@AA@SPI@MIP和Fe3O4@AA@NIP分別分散在50 mL錐形瓶中。每個錐形瓶中加入20 mL不同質量濃度的SPI水溶液(0.5～20 μg/mL),超聲萃取10 min后,在30 ℃恒溫條件下放置1 h進行吸附,之后通過磁場相分離。用水簡單淋洗吸附劑表面,再用8 mL 20% (v/v)乙酸-甲醇超聲10 min,使SPI從吸附劑中完全洗脫。洗脫液在40 ℃用氮氣吹干后用10% (v/v)甲醇-水重溶至500 μL,經0.22 μm有機膜過濾后檢測。根據(jù)公式(1)計算不同質量濃度下達到吸附平衡的吸附量(Qe, mg/g):

Qe=Ce×V/M

(1)

其中,Ce(μg/mL)是達到吸附平衡時目標分析物洗脫重溶后的質量濃度,V(mL)是重溶體積,M(mg)是吸附劑的質量。

吸附平衡時間的考察:同樣取10 mg上述兩種吸附劑,使用質量濃度為1.5 μg/mL的SPI水溶液上樣。萃取過程同上。在30 ℃恒溫條件下放置10～120 min。根據(jù)公式(2)計算不同時間的吸附量(Qt, mg/g):

Qt=Ct×V/M

(2)

其中,Ct(μg/mL)是不同吸附時間下目標分析物洗脫重溶后的質量濃度。

Fe3O4@AA@SPI@MIP的識別能力采用印跡因子α表征,參考相關文獻[18,19],印跡因子的計算公式為:

α=QMIP/QNIP

(3)

其中,QMIP和QNIP(mg/g)分別為Fe3O4@AA@SPI@MIP和Fe3O4@AA@NIP對SPI的飽和吸附量。

1.5 蜂蜜樣品的前處理

在空白蜂蜜樣品中添加10～200 μg/L(0.1～2 mg/kg)的4種MA標準品,繪制基質添加標準曲線;在低中高3個水平(50、100和150 μg/L)計算加標回收率和精密度。

2 結果和討論

2.1 Fe3O4@AA@SPI@MIP合成條件的優(yōu)化

Fe3O4的功能化通過丙烯酸的羧基和磁性納米鐵表面殘留的Fe3+發(fā)生絡合反應進行[20]。合成條件的優(yōu)化結果(數(shù)據(jù)未提供)表明,無水DMSO作為致孔溶劑效果好,模板分子/功能單體/交聯(lián)劑的物質的量之比為1∶14∶28時效果最佳,Fe3O4@AA與反應單體(包括模板分子、功能單體和交聯(lián)劑)的比例為250 mg∶0.125 mmol(SPI)時吸附性能最好。

2.2 吸附劑的表征

Fe3O4@AA@SPI@MIP的BET表征結果顯示,Fe3O4@AA@SPI@MIP比表面積為11.63 m3/g,略大于Fe3O4@AA@NIP的比表面積(8.70 m3/g)。由掃描電鏡(SEM)表征結果看出,吸附劑基本呈球形(見圖2), Fe3O4的粒徑為20 nm, Fe3O4@AA@SPI@MIP的粒徑增至約200 nm, Fe3O4@AA@NIP的粒徑約為150 nm。在反應單體用量相同的情況下,合成MIP過程中加入了模板分子,使得聚合物表面及殼層中都存在許多印跡位點,相比NIP的聚合層增加了印跡空腔的空間,所以MIP具有更大的粒徑。去除模板分子后的MIP留有印跡空腔,具有增大比表面積的作用。

圖 2 (a)Fe3O4@AA@SPI@MIP和(b)Fe3O4@AA@NIP 的掃描電鏡圖Fig. 2 SEM images of (a) Fe3O4@AA@SPI@MIP and (b)Fe3O4@AA@NIP

圖 3 磁性納米粒子的(a)FT-IR和(b)VSM圖Fig. 3 (a) FTIR and (b) VSM spectra of magnetic nanoparticles

FT-IR及振動樣品磁強計譜(VSM)的表征結果見圖3。Fe3O4@AA@SPI@MIP和Fe3O4@AA@NIP在1 161 cm-1和1 730 cm-1處有特征吸收,分別對應飽和酯類的-C-O和-C=O的伸縮振動,表明在磁鐵表面成功進行了聚合反應。需要指出的是,低波數(shù)處的基線有漂移,這可能是與樣品自身特有性質有關(樣品呈黑色,是按照樣品和KBr質量比為1∶100壓制得到的薄片),但這并不影響定性分析;Fe3O4@AA在578 cm-1處的振動吸收增強,可能是配位鍵的存在使得Fe-O鍵不對稱性增強,振動吸收增強。根據(jù)測量,Fe3O4@AA@SPI@MIP的磁化強度為80.408 emu/g, Fe3O4@AA@NIP的磁化強度為79.834 emu/g,兩者結果接近。據(jù)文獻[21]報道,粒徑16 nm的商品化Fe3O4磁化強度為84.5 emu/g。所以,最終得到的吸附劑磁性并未受到聚合層的影響,在外加磁場下能夠實現(xiàn)快速分離(見圖3)。文獻報道以羅丹明B羥脯氨酸衍生物為模板分子的磁性MIP的磁化強度為20.6 emu/g[22],以嗎啡為模板分子的磁性MIP的磁化強度為13.02 emu/g[23]。相比之下,本文的吸附劑具有更高的磁化強度,高磁化強度顯然更利于萃取后的有效相分離。

2.3 吸附實驗結果

吸附平衡曲線和動力學吸附曲線見圖4。由圖4a可以看出,在低濃度區(qū)兩種吸附劑的吸附量很接近;隨著樣品濃度的增加,Fe3O4@AA@SPI@MIP的吸附量增加幅度明顯高于Fe3O4@AA@NIP,相應的二者吸附量差異明顯變大。當樣品質量濃度達到16 μg/mL時,Fe3O4@AA@SPI@MIP的吸附趨于飽和。通過計算可得到Fe3O4@AA@SPI@MIP的飽和吸附量QMIP=2.37 mg/g,遠高于Fe3O4@AA@NIP的飽和吸附量(QNIP=0.67 mg/g)。這顯然有利于得到更高的吸附容量。另外,Fe3O4@AA@SPI@MIP的印跡因子α為3.54;在1.5 μg/mL下,兩種吸附劑隨著靜置時間的增加,吸附量增加,60 min達到吸附平衡。

圖 4 Fe3O4@AA@SPI@MIP和Fe3O4@AA@NIP對螺旋 霉素的(a)吸附平衡曲線和(b)動力學吸附曲線(n=3)Fig. 4 (a) Adsorption equilibrium curve and(b) kinetic binding curve of spiramycin toward Fe3O4@AA@SPI@MIP and Fe3O4@AA@NIP (n=3)

2.4 富集效果考察

Fe3O4@AA@SPI@MIP對4種MA的富集效果見圖5。與直接進樣對比,4種MA(SPI、JOS、TIL、TYL)通過吸附劑處理之后均得到了有效的富集。按照文獻[10]的計算方法,上述4種MA富集倍數(shù)分別為310、118、758和72。該吸附劑對TIL具有最高的富集倍數(shù)。可能是因為TIL和SPI化學結構相似,且空間結構小于SPI,因而更容易被印跡位點識別并結合。

圖 5 Fe3O4@AA@SPI@MIP對4種MA的富集效果圖Fig. 5 Enrichment effect of Fe3O4@AA@SPI@MIP towards four MA Mobile phase: A, 0.02% (v/v) H3PO4/H2O; B, MeOH. Gradient mode: 0-10 min, 10%B-90%B; 10-12 min, 90%B. UV detection: 232 nm (SPI, JOS) and 282 nm (TIL, TYL); injection volume: 20 μL; flow rate: 1 mL/min; column temperature: 25 ℃; loading volume: 200 mL; redissolution volume: 200 μL. 1. spiramycin; 2. josamycin; 3, tilmicosin; 4. tylosin tartrate.

2.5 萃取條件優(yōu)化和循環(huán)使用次數(shù)

為保證Fe3O4@AA@SPI@MIP達到最佳萃取效果,對其萃取條件進行了優(yōu)化(數(shù)據(jù)未顯示)。結果表明,當上樣溶液pH近乎中性(pH 6)、不含無機鹽時可達到最佳吸附效果,洗脫溶液為5% (v/v)乙酸-甲醇、洗脫液體積為3 mL即可達到目標抗生素的完全洗脫。將上述優(yōu)化的萃取條件用于后續(xù)蜂蜜樣品的萃取實驗。優(yōu)化結果的可能原因是,目標抗生素在甲醇中易溶,而乙酸的存在會破壞目標抗生素與吸附劑間的氫鍵作用。弱堿性的抗生素在弱酸性溶液中帶正電荷,與Fe3O4@AA@SPI@MIP結構中的羧基具有離子間作用,和氫鍵作用共同影響吸附劑和抗生素間的相互作用,在pH 6時達到最佳吸附效果。無機鹽的存在會干擾目標分子和吸附劑間的離子鍵作用及氫鍵作用。在優(yōu)化后的萃取條件下,取3份Fe3O4@AA@SPI@MIP,每份10 mg,重復使用6次。結果表明,6次重復得到的峰面積基本保持不變(所得峰面積相對標準偏差為5% ～11% ),這表明該吸附劑可重復使用。

2.6 蜂蜜樣品中MA的萃取和定量

方法的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限結果見表1。蜂蜜樣品加標回收率和精密度結果見表2。結果顯示,在10～200 μg/L(0.1～2 mg/kg)質量濃度范圍內,4種MA的峰面積(Y)和對應的質量濃度(X, μg/L)的線性方程呈現(xiàn)出良好的線性關系(R2≥0.99); 4種MA的檢出限為0.53～2.75 μg/L,定量限為1.78～9.16 μg/L;方法回收率在80.78% ～123.02%之間,相對標準偏差(RSD)<15.85% 。

Leal等[24]采用HPLC-UV測定雞肉樣品中幾種抗生素。該方法對交沙霉素和SPI抗生素的檢出限范圍為6～33 μg/L。盡管由于基質不同無法直接類比,但仍可以看出本文方法具有較低的檢出限。

表14種MA的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、LOD以及LOQ(n=3)

Table1Linearranges,linearequations,correlationcoefficients(R2),LODandLOQofthefourmacrolideantibiotics(n=3)

AnalyteLinear range/(μg/L)Linear equationR2LOD/(μg/L)LOQ/(μg/L)Spiramycin10-200Y=(343.7±20.4)X+(5467.9±1264.1)0.98982.759.16Josamycin10-200Y=(615.2±31.9)X+(6436.2±1925.6)0.99511.906.34Tilmicosin10-200Y=(1064.1±7.9)X+(15190.5±449.8)0.99730.531.78Tylosin tartrate10-200Y=(209.5±15.2)X+(2484.4±859.7)0.99080.902.99

LOD and LOQ are calculated at signal to noise ratio of 3 and 10, respectively;Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 2 蜂蜜樣品中3個水平下的MA加標回收率Table 2 Recoveries of macrolide antibiotics in honey samples spiked at three levels

Background: not detected.

圖 6 C18和Fe3O4@AA@SPI@MIP凈化蜂蜜樣品的效果對比Fig. 6 Comparison of purification effect on honey sample between C18 and Fe3O4@AA@SPI@MIP Conditions are the same as Fig. 5 except that the loading volume is 100 mL. 1. spiramycin; 2. josamycin; 3, tilmicosin; 4. tylosin tartrate.

另外,為了考察所發(fā)展吸附劑的選擇性,特選擇常規(guī)C18型吸附劑進行了對比,結果如圖6所示,可以看出本文所發(fā)展的Fe3O4@AA@SPI@MIP吸附劑在處理蜂蜜樣品時能有效凈化基質,干擾物質少。相比之下C18不存在特異性吸附,基質干擾嚴重,無法對添加的痕量目標抗生素進行富集,故無法準確定量。

3 結論

本文合成出螺旋霉素為模板分子的分子印跡磁性納米吸附劑。該吸附劑對MA表現(xiàn)出良好的富集效果,可結合HPLC-UV法用于蜂蜜樣品中4種目標MA的測定。該吸附劑還有望用于處理含其他類型的MA,為HPLC-UV法測定包括蜂蜜在內的其他食品中痕量MA提供了一種樣品前處理的新選擇。