三聚氰胺磁性表面分子印跡聚合物的制備及其在牛奶樣品中的應用

孫治安, 祁玉霞, 王 霞, 周彥強, 龔波林

(北方民族大學化學與化學工程學院, 寧夏 銀川 750021)

三聚氰胺(MEL)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物,主要用于生產(chǎn)甲醛清潔劑、三聚氰胺甲醛樹脂等,在皮革、塑料、紡織、造紙、涂料等行業(yè)有廣泛應用。中國國家食品質量監(jiān)督檢驗中心曾明確指出三聚氰胺屬于化工原料,不允許添加到食品中。但因其含氮量高(66.6% ),曾多次被人為添加到食品和飼料中,以增加食品中蛋白質的含量。2007年年初,美國發(fā)生了多起貓、狗寵物因食用含三聚氰胺的寵物食品而中毒死亡的事件;2008年9月,中國發(fā)生奶制品污染事件,多個品牌的嬰幼兒奶粉檢出三聚氰胺。這也引起了國內外對三聚氰胺及其同系物含量檢測技術的重視。

牛奶的組成成分復雜,要從牛奶中檢測低濃度的三聚氰胺十分困難。目前檢測牛奶中三聚氰胺的方法主要有液相色譜法[1]、氣相色譜-質譜法[2]、液相色譜-質譜法[3]、電化學檢測法[4]、毛細管電泳-質譜法[5]和拉曼光譜法[6]等，但預處理過程耗時長是這些方法共有的缺陷。為了加快檢測過程,有必要開發(fā)能夠快速分離,且具有高選擇性、高吸附容量和低檢出限的新方法。

磁分離技術能夠簡便而快速的分離磁性納米粒子,分子印跡技術能夠對目標化合物進行特異性識別,將二者結合,可以同時實現(xiàn)對目標化合物的選擇性吸附與快速分離[7]。陳朗星等[8]制備了核殼結構的萘夫西林磁性表面分子印跡聚合物(MMIPs),該MMIPs對模板分子具有很高的吸附容量,特異性識別性能良好。傳統(tǒng)三聚氰胺分子印跡聚合物(MIPs)采用沉淀聚合法或本體聚合法制備[9,10]。采用這些方法制備的MIPs選擇性高,但是吸附容量低,模板分子不易洗脫[11,12],而表面分子印跡技術有效地克服了這兩類制備方法的缺陷[13]。佟育奎等[14]在Fe3O4磁性納米粒子表面制備了氟喹諾酮類抗生素分子印跡層,該MMIPs可應用于環(huán)境水樣中氟喹諾酮類抗生素的殘留檢測。Wang等[15]用制備的磁性納米材料檢測牛奶中的三聚氰胺,效果理想,但不足之處是仍需離心和溶劑萃取,尚未完全開發(fā)材料的磁性能。Chen等[16]和Wang等[12]合成的磁性分子印跡聚合物可以直接添加到樣品中,不需要額外的過濾和離心,簡化了前處理過程。張麗麗等[17]制備了三聚氰胺分子印跡表面等離子體共振傳感器,是三聚氰胺檢測的一大進步。但是,目前尚未見以Fe3O4@SiO2為載體，采用MMIPs從牛奶中一步提取和分離三聚氰胺的相關報道。

本文以Fe3O4@SiO2磁性材料為載體、三聚氰胺為模板分子,選擇α-甲基丙烯酸(MAA)作為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)作為交聯(lián)劑，制備了MEL-MMIPs,并將MEL-MMIPs用于富集和分離牛奶中的三聚氰胺。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AT高效液相色譜儀、FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本Shimadzu公司); TU-1810紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司); JEM-2100透射電子顯微鏡(日本JEM公司); VSM-7404振動樣品磁強計(美國Lakeshore公司); SETSYS-1750 CS Evol熱重分析儀(TGA,法國塞塔拉姆儀器公司)。

γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS,純度98% )、正硅酸乙酯(TEOS,純度99.99% )、鹽酸羥胺(純度98.5% )、吡啶(純度99.5% )購于阿拉丁試劑(上海)有限公司;三聚氰胺(純度99.9% )、三聚氰酸(CYA,純度99% )、滅蠅胺(CYR,純度99% )、α-甲基丙烯酸(純度98% )、2,2-偶氮二異丁腈(AIBN,純度99% )、乙二醇二甲基丙烯酸酯(純度98% )購于上海晶純生化科技股份有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗條件

1.2.1磁性Fe3O4納米材料的制備

在燒瓶中加入含0.05 mol/L FeCl3的乙醇-水(1∶1, v/v)溶液60 mL,于50 ℃水浴加熱,以100 r/min的速率機械攪拌,然后加入0.051 1 g鹽酸羥胺,反應5 min后,滴加30%(質量分數(shù))濃氨水至pH>9,再滴加1 mL油酸,繼續(xù)反應10 min,然后將溫度升至70 ℃反應30 min。反應結束后,將燒瓶置于室溫下,待磁性顆粒自由沉降后,移去上清液,然后加入100 mL熱的無水乙醇,洗滌磁性顆粒,重復洗滌3次,將洗滌過的磁性顆粒置于60 ℃真空干燥箱中干燥12 h,備用。

1.2.2磁性Fe3O4@SiO2材料的制備

稱取0.2 g磁性Fe3O4納米材料置于燒瓶中,加入200 mL乙醇-水(6∶1, v/v)溶液,超聲分散均勻,加入2 mL 30%(質量分數(shù))濃氨水,在100 r/min的速率下機械攪拌,緩慢滴加1 mL正硅酸乙酯,然后將燒瓶密封,反應20 h。反應完畢后將產(chǎn)物磁性分離,用超純水洗滌至中性,干燥備用。

1.2.3Fe3O4@SiO2@MPS的制備

稱取1.0 g Fe3O4@SiO2置于燒瓶中,量取乙醇-水(1∶1, v/v)混合溶液100 mL,超聲分散均勻后,于室溫下以100 r/min的速率進行機械攪拌,加入1.3 mL MPS,再加入3～4滴吡啶,升溫至50 ℃,攪拌反應24 h。反應完畢后產(chǎn)物用乙醇洗滌3次,然后用無水乙醇索氏提取24 h。

1.2.4MEL-MMIPs和MEL-非印跡聚合物(MNIPs)的制備

稱取0.126 g三聚氰胺置于燒瓶內,量取30 mL乙醇-水(4∶1, v/v)溶液,超聲溶解,然后加入0.34 mL MAA,于室溫下以100 r/min的速率機械攪拌6 h,靜置過夜。然后加入1.0 g Fe3O4@SiO2@MPS磁性材料、3.8 mL EGDMA和40 mg AIBN,通入氮氣除氧30 min,密封，然后于60 ℃反應24 h。將反應產(chǎn)物進行磁分離,然后用甲醇洗滌數(shù)次后真空干燥,再用甲醇-冰乙酸(4∶6, v/v)索氏提取24 h,最后用甲醇洗去表面的乙酸,即得到MEL-MMIPs，其制備過程見圖1。MEL-MNIPs的制備過程除不加模板分子外,其余步驟與制備MEL-MMIPs時相同。

圖 1 三聚氰胺磁性表面分子印跡聚合物的制備過程Fig. 1 Preparation process of melamine magnetic surface molecularly imprinted polymers (MEL-MMIPs) TEOS: tetraethyl orthosilicate; MPS: 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate; MAA: methacrylic acid; EGDMA: ethyleneglycol dimethacrylate; AIBN: 2,2′-azobis(2-methylpropionitrile).

1.2.5樣品前處理

量取10 mL牛奶樣品,加入20 mL乙腈,然后加入適量三聚氰胺標準溶液(使樣品溶液中三聚氰胺的含量為300 μg/L)，超聲分散均勻,以10 000 r/min離心10 min,得到牛奶上清液,備用。

稱取20.0 mg MEL-MMIPs,置于25 mL容量瓶中,加入牛奶上清液定容。將溶液轉移至錐形瓶中,置于搖床上振蕩吸附,之后用磁鐵分離出MEL-MMIPs,經(jīng)甲醇-乙酸(9∶1, v/v)溶液洗脫后,再次用磁鐵分離出MEL-MMIPs,洗脫液利用旋轉蒸發(fā)儀蒸干。然后加入1 mL乙腈再次溶解,經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾,待測。

1.2.6色譜條件

色譜柱:Luna HILIC柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Phenomenex公司);流動相:乙腈-10 mmol/L乙酸銨(9∶1, v/v);進樣量:20 μL;檢測波長:210 nm。

1.3 等溫吸附量的測定

分別準確稱取一定質量的MEL-MMIPs和MEL-MNIPs,置于50 mL錐形瓶中,加入含20～120 mg/L三聚氰胺的乙醇-水(1∶1, v/v)溶液各10 mL,于室溫下振蕩吸附24 h, 以5 000 r/min離心5 min,過0.22 μm尼龍濾膜后測定其吸光度,并按公式(1)計算吸附量:

Q=(C0-Ce)V/m

(1)

其中,Q是吸附量(mg/g),C0是MEL的初始濃度(mg/L),Ce是MEL吸附平衡時的濃度(mg/L),V是溶液體積(L),m是MEL-MMIPs或者MEL-MNIPs的質量(g)。

1.4 吸附動力學的測定

稱取6份0.020 g MEL-MMIPs置于錐形瓶中，分別加入10 mL含50 mg/L三聚氰胺的乙醇-水(4∶1, v/v)溶液,于25 ℃恒溫振蕩,每隔10 min取出一組樣品,以5 000 r/min離心5 min,過0.22 μm尼龍濾膜,測定三聚氰胺的濃度。采用同樣方法對MEL-MNIPs進行處理。采用公式(1)計算MEL-MMIPs和MEL-MNIPs對MEL的吸附量。

1.5 吸附選擇性的測定

分別配制MEL、CYA和CYR的乙醇-水(1∶1, v/v)溶液,使其質量濃度均為90 mg/L。分別準確稱取3份0.020 g MEL-MMIPs,共3組,加入上述含MEL、CYA和CYR的乙醇-水溶液10 mL,恒溫振蕩24 h,然后測其吸光度,按公式(1)計算吸附量。按照相同方法測定MEL-MNIPs。

2 結果與討論

2.1 三聚氰胺與甲基丙烯酸的復合作用

將MEL與MAA按不同物質的量之比(1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8)溶于乙醇-水(1∶1, v/v)溶液中,MEL的濃度均為0.2 mmol/L,對其進行紫外光譜分析(見圖2)。可以看出,隨著MAA濃度的增加,溶液的吸光度逐漸增加,但是增加量逐漸減小,而且溶液的吸收波長有紅移現(xiàn)象,說明隨著MAA濃度的增加,MEL與MAA之間作用力逐漸增強,但是當MEL與MAA物質的量之比超過1∶4時,相互作用力的增加幅度變小,這也說明1∶4是MEL與MAA的最佳配比。

圖 2 不同物質的量之比的MEL和MAA的紫外光譜圖Fig. 2 Ultraviolet spectra of different molar ratio of MAA to MEL

圖 3 三聚氰胺與甲基丙烯酸在乙醇-水溶液中的紫外光譜圖Fig. 3 UV spectra of melamine and methacrylic acid in ethanol aqueous solution

為進一步證明三聚氰胺與甲基丙烯酸間存在較強的復合作用，形成了穩(wěn)定的復合物。配制含0.1 mmol/L三聚氰胺、0.4 mmol/L甲基丙烯酸和三聚氰胺與甲基丙烯酸物質的量之比為1∶4的乙醇-水(4∶1, v/v)溶液,于25 ℃下振蕩30 min,靜置12 h,然后對其進行紫外光譜分析(見圖3)?？梢钥闯?MEL與MAA混合溶液的吸收波長有紅移現(xiàn)象,且MEL與MAA混合溶液的吸光度值明顯低于MEL和MAA吸光度值的加和。理論上,如果MEL與MAA之間沒有相互作用,那么在所有波長下混合溶液的吸光度值是二者在同等條件下單獨存在時吸光度值之和;相互作用越強,則吸光度值差別越大。因此,測定結果說明MEL與MAA之間產(chǎn)生了明顯的相互作用,形成了比較穩(wěn)定的復合物。

2.2 透射電鏡表征

用透射電鏡(TEM)對磁性Fe3O4納米粒子(見圖4a)和MEL-MMIPs(見圖4b)的形貌進行表征。可以看出,磁性Fe3O4納米粒子的分散性良好,粒徑約為20 nm; MEL-MMIPs的粒徑明顯增大,表明印跡層成功包覆在Fe3O4納米粒子表面,證實了制備的MEL-MMIPs具有核殼結構。

圖 4 (a)Fe3O4納米粒子和(b)MEL-MMIPs的透射電鏡圖Fig. 4 Transmission electron microscope (TEM) images of (a) Fe3O4 nanoparticles and (b) MEL-MMIPs

2.3 紅外光譜分析

Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS和MEL-MMIPs的紅外光譜圖見圖5。其中,圖5a和5b中的469.7 cm-1和576.3 cm-1處是Fe-O鍵彎曲和伸縮振動的特征吸收峰,說明Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-MPS具有相同的內核,而MEL-MMIPs由于聚合物層的存在使得Fe-O鍵特征吸收峰不明顯。圖5a中的792.3 cm-1是Si-O鍵的伸縮振動峰;948.4 cm-1是Si-O-H鍵的伸縮振動峰;1 081.1 cm-1是Si-O-Si鍵不對稱伸縮振動強吸收峰,說明Fe3O4納米粒子表面成功包覆了一層SiO2。圖5b中1 715.9 cm-1是MPS中的C=O伸縮振動峰,說明MPS成功接枝到Fe3O4@SiO2表面。圖5c中1 739.4 cm-1是O-C=O酯基吸收峰,說明EGDMA成功鍵合到磁性材料表面；2 988.3 cm-1處是羧基的吸收峰,說明MAA成功鍵合到磁性材料表面。

圖 5 (a)Fe3O4@SiO2、(b)Fe3O4@SiO2-MPS和(c)MEL- MMIPs的紅外光譜圖Fig. 5 FT-IR spectra of (a) Fe3O4@SiO2, (b) Fe3O4@ SiO2-MPS, and (c) MEL-MMIPs

2.4 熱重分析

Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS和MEL-MMIPs磁性微球的熱重曲線圖見圖6。Fe3O4和Fe3O4@SiO2的失重率僅為8% , Fe3O4@SiO2-MPS的失重率僅為13% ,說明Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-MPS均具有良好的熱穩(wěn)定性。在400～800 ℃之間, Fe3O4@SiO2-MPS的失重率高于Fe3O4@SiO2,說明Fe3O4@SiO2表面成功接枝了MPS。由于印跡層的分解,在250～450 ℃之間,MEL-MMIPs的失重很快,失重率高達80.4% 。

圖 6 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS 和MEL-MMIPs的熱重曲線Fig. 6 Thermogravimetric analysis (TGA) curves of Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-MPS and MEL-MMIPs

2.5 振動磁強計分析

油酸改性Fe3O4納米粒子、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS、MEL-MMIPs的磁滯回線和在外界磁場作用下MEL-MMIPs的磁分離現(xiàn)場圖片見圖7?？梢钥闯?油酸改性Fe3O4納米粒子、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS和MEL-MMIPs的飽和磁化強度分別為60.67、27.10、21.76和4.10 emu/g。隨著表面聚合物厚度的增加,Fe3O4納米粒子、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS和MEL-MMIPs的飽和磁化強度依次降低。MEL-MMIPs的飽和磁化強度最小。如圖7所示,沒有磁場時,MEL-MMIPs磁性微球穩(wěn)定、均勻地分散在乙醇溶液中;外加磁場后,磁性微球被快速、完全吸附到容器內壁上。

圖 7 Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-MPS和MEL- MMIPs的磁滯回線和磁分離現(xiàn)象照片F(xiàn)ig. 7 Hysteresis loops of Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@ SiO2-MPS and MEL-MMIPs and magnetic separation photo of MEL-MMIPs

2.6 等溫吸附量的考察

對MEL-MMIPs和MEL-MNIPs進行等溫吸附試驗,結果如圖8所示,可以看出,MEL-MMIPs和MEL-MNIPs對MEL的吸附量有明顯差別,飽和吸附量分別為8.74和3.48 mg/g,優(yōu)于文獻[18]報道的數(shù)據(jù),表明MEL-MMIPs對三聚氰胺具有良好的吸附性能。

圖 8 不同三聚氰胺質量濃度下(a)印跡聚合物和(b)非印跡 聚合物對三聚氰胺的吸附量Fig. 8 Adsorption of (a) imprinted polymers and (b) non-imprinted polymers with different mass concentrations of MEL

通過Scatchard模型對等溫吸附的結果進行分析,Scatchard方程為:

(2)

式中Qmax和Kd分別是MEL-MMIPs最大表觀吸附量(mg/g)和平衡離解常數(shù)(mg/L)。

結果得到兩條擬合直線,高親和力直線方程是:Q/Ce=-0.002 72Q+0.209 08,低親和力直線方程是:Q/Ce=-0.620 06×10-5Q+0.198 83。表明MEL-MMIPs對模板分子有兩種不同性質的結合位點。這種情況通常會在非共價印跡法的吸附過程中出現(xiàn),其中專一性吸附是由高親和位點決定的。

2.7 吸附動力學考察

按1.4節(jié)描述對MEL-MMIPs和MEL-MNIPs進行吸附動力學分析,其結果見圖9。由圖9可知,吸附在40 min時達到飽和,MEL-MMIPs具有較高的吸附速率,其吸附量也遠高于MEL-MNIPs。

圖 9 印跡聚合物和非印跡聚合物 的吸附動力學曲線Fig. 9 Adsorption kinetic curves of imprinted polymers and non-imprinted polymers

2.8 吸附選擇性的考察

按1.5節(jié)描述測定MEL-MMIPs和MEL-MNIPs對MEL的吸附選擇性。結果表明,MEL-MMIPs對MEL、CYA和CYR的吸附量分別是8.79、2.63和1.13 mg/g, MEL-MNIPs對MEL、CYA和CYR的吸附量分別是3.47、3.6和1.6 mg/g。MEL-MMIPs對MEL的吸附量遠高于對CYA和CYR的吸附量,同時也高于MEL-MNIPs對三者的吸附量,表明MEL-MMIPs對三聚氰胺具有較好的特異識別性。

2.9 檢出限和回收率

對三聚氰胺樣品進行加標回收試驗，加標水平分別為200、300和500 μg/L,每個水平做3個平行樣品。結果表明，三聚氰胺的加標回收率為85.6% ～104.2%,RSD≤8.3%(n=3)(見表1)。

配制系列濃度的三聚氰胺標準溶液，按1.2.6節(jié)進行分析，以3倍信噪比(S/N)對應的含量計算方法的檢出限，為15 μg/L。

表 1 牛奶樣品中MEL的加標回收率和相對標準偏差(n=3)Table 1 Spiked recoveries and RSDs of MEL in milk samples (n=3)

圖 10 實際牛奶樣品的色譜圖Fig. 10 Chromatograms of the real milk samples a. the blank milk sample extracted by MEL-MMIPs; b. the spiked milk sample (300 μg/L MEL) extracted by MEL-MMIPs; c. the spiked milk sample (300 μg/L MEL) extracted by MEL-MNIPs.

2.10 實際樣品分析

實際牛奶樣品經(jīng)印跡聚合物和非印跡聚合物萃取后的色譜圖見圖10?？梢钥闯?MEL-MMIPs對三聚氰胺的分離富集效果比MEL-MNIPs明顯要好,表明MEL-MMIPs可以用來富集分離牛奶中的三聚氰胺。

3 結論

本研究成功地在Fe3O4納米粒子表面制備了MEL-MMIPs,該MEL-MMIPs具有良好的磁學性能和較高的吸附速率。與傳統(tǒng)檢測方法相比,本方法操作簡便,溶劑消耗少,成本低,檢測速度快。所制備的MEL-MMIPs有望作為三聚氰胺檢測的新材料,對于加快三聚氰胺的檢測速度、提高檢測的靈敏度與選擇性和保障食品安全具有重要意義。