冠脈康顆粒對(duì)急性腦缺血小鼠腦組織炎癥因子的影響

高小明，鄒桂欣，張 穎*

0 引言

冠脈康顆粒(GMK)是我院國家級(jí)老中醫(yī)洪治平老師的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由瓜蔞、丹參、葛根等中藥組成，具有活血化瘀、開胸祛痰之功效，臨床可以治療痰瘀阻絡(luò)型冠心病[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，冠脈康膠囊[2](與GMK劑型不同)具有抗血栓形成、抗急性腦缺血作用。根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)可知，方中有12個(gè)化學(xué)組分與GMK抗缺血的藥效密切相關(guān)，其中瓜蔞(君藥)的化學(xué)成分多，貢獻(xiàn)最大[1]。藥理研究發(fā)現(xiàn),腦缺血可影響多種炎性細(xì)胞因子，許多生化和分子基因?qū)W方面的實(shí)驗(yàn)都證明了白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)在腦缺血中的調(diào)節(jié)作用[3-5]。本研究旨在對(duì)GMK抗急性腦缺血作用進(jìn)行研究，并對(duì)小鼠腦內(nèi)IL-1β等相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行初步分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠(SPF)，體重18～22 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(遼)2010-0001]。動(dòng)物購買后飼養(yǎng)觀察1周，實(shí)驗(yàn)室溫度：20～25 ℃，濕度：50%～60%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑盒 冠脈康顆粒由遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)室提供；IL-1β、TNF-α、PGE2試劑盒購于南京建成生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GMK對(duì)小鼠急性腦缺血的影響 取健康小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，即空白對(duì)照組(僅灌胃給予生理鹽水),冠脈康高、中、低劑量組(配制濃度為18.0、9.0、4.5 g/kg)，陽性對(duì)照組(心血寧0.66 g/kg)。灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。于末次給藥30 min后，將各組小鼠于耳后2 mm處迅速斷頭，造成急性腦缺血，立即記錄小鼠斷頭后呼吸次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。

1.2.2 GMK對(duì)小鼠全腦IL-1β、TNF-α和PGE2含量的影響 冰浴上剝離全腦，生理鹽水清洗后用濾紙吸干血液，稱重。加9倍冷PBS于電動(dòng)勻漿器中研磨，4 ℃離心10 min，取上清液，酶標(biāo)儀(450 nm)分別測(cè)定IL-1β、TNF-α、PGE2的OD值(具體步驟詳見試劑盒說明書，樣品孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔為復(fù)孔)，計(jì)算含量。

2 結(jié)果

2.1 GMK對(duì)小鼠急性腦缺血呼吸次數(shù)和持續(xù)時(shí)間的影響 與空白對(duì)照組比較，GMK高劑量組和心血寧組小鼠斷頭后呼吸時(shí)間顯著延長，呼吸次數(shù)增加(P<0.05)，表明GMK具有改善急性腦缺血的作用。見表1。

表1 冠脈康顆粒小鼠斷頭缺血模型呼吸次數(shù)及持續(xù)時(shí)間比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 GMK對(duì)小鼠全腦IL-1β、TNF-α和PGE2含量的影響 與空白對(duì)照組比較，灌胃給予小鼠GMK 18.0 g生藥/kg，連續(xù)7 d，能顯著降低小鼠全腦IL-1β、PGE2含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TNF-α含量有降低的趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 GMK對(duì)小鼠全腦IL-1β、TNF-α和PGE2含量的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

腦缺血的作用機(jī)制復(fù)雜，是一個(gè)由多種因素參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，腦缺血損傷后，腦內(nèi)多種細(xì)胞參與了神經(jīng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展。腦內(nèi)皮細(xì)胞以及被激活的白細(xì)胞所產(chǎn)生和釋放的炎性因子，如IL-1β和TNF-α等，可作為炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子，通過損傷神經(jīng)細(xì)胞、破壞血腦屏障、影響神經(jīng)再生過程等多種途徑影響腦缺血損傷的過程[6-7]。

PGE2是廣泛存在于動(dòng)物和人體內(nèi)的花生四烯酸代謝產(chǎn)物，有研究認(rèn)為，顱腦損傷可引起腦組織膜磷脂代謝障礙，花生四烯酸代謝瀑布被激活，環(huán)氧合酶2途徑產(chǎn)生的PGE2異常升高，在缺血性腦損傷中，PGE2與腦水腫的產(chǎn)生顯著相關(guān)[8]。

TNF-α是重要的致炎細(xì)胞因子，主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物活性，能誘導(dǎo)炎癥和調(diào)節(jié)免疫功能。有報(bào)道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)許多細(xì)胞均可分泌TNF-α，后者可能介入腦損傷后的多種病理生理反應(yīng)[9]。給腦損傷動(dòng)物模型注射TNF-α抗體，腦水腫和血腦屏障的損傷明顯減輕[10]。TNF能單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子(如IL-1等)聯(lián)合激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生一氧化氮。

IL-1β作為急性炎性因子，廣泛參與感染、缺血再灌注等病理過程，其主要來源于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，是腦缺血損傷炎性過程的關(guān)鍵因子[11-12]。有研究報(bào)道，大鼠瞬時(shí)腦缺血模型中IL-1β表達(dá)增高[13]，應(yīng)用IL-1β注射大腦，可加重腦缺血[14]。腦缺血后，神經(jīng)組織的IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達(dá)顯著升高[15]，呈正相關(guān)，推測(cè)IL-1β可能受TNF-α調(diào)節(jié)，共同參與缺血性腦損傷病理生理過程。

在GMK方中，君藥瓜蔞主要含有糖苷、萜類及有機(jī)酸類成分，在抗腦缺血、促進(jìn)免疫作用方面發(fā)揮療效，可以顯著提高巨噬細(xì)胞活性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化[16]；臣藥丹參，活血祛瘀，其有效成分丹參酮ⅡA可以減輕中性粒細(xì)胞在缺血腦組織的浸潤，減少炎性介質(zhì)的釋放，改善腦缺血的炎癥反應(yīng)[17]；方中葛根有效成分葛根素能抑制腦缺血再灌注模型炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等的釋放，改善神經(jīng)炎癥[18]。本研究結(jié)果表明，GMK能顯著延長小鼠斷頭后呼吸時(shí)間和呼吸次數(shù)，降低小鼠全腦IL-1β和PGE2含量。推測(cè)GMK所含的多種有效成分可以通過抑制IL-1β和PGE2的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腦缺血損傷的過程，起到改善急性腦缺血的作用。