PEP-1-SOD聯(lián)合N-乙酰半胱氨酸對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

曾 艷，趙韶靜，張 任，李正東

0 引言

順鉑(Cisplatin，CDDP)作為抗腫瘤藥物，既可單獨(dú)使用，也可在中西醫(yī)聯(lián)合用藥方案中聯(lián)合應(yīng)用，在臨床上具有高效和廣譜特性[1-7]。但是該藥物具有一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如急性腎功能損傷(Acute kidney injury,AKI)或更嚴(yán)重的不可逆慢性腎功能衰竭，均在很大程度上限制順鉑的臨床應(yīng)用[8]。研究顯示，腎臟氧化性應(yīng)激頻率的增加與CDDP對(duì)腎臟損傷作用聯(lián)系緊密，作用機(jī)制為CDDP促使活性氧代謝產(chǎn)物產(chǎn)生[9-10]。而導(dǎo)致該代謝產(chǎn)物出現(xiàn)的主要原因?yàn)?，腎臟組織遭到一定損傷致使氧自由基代謝失衡，伴隨腎組織脂質(zhì)氧化物濃度的增加[11]。因此，探索PEP-1-SOD聯(lián)合N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對(duì)急性腎損傷小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響對(duì)急性腎損傷的治療具有重要的提示作用。本研究采用PEP-1-SOD聯(lián)合NAC對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠進(jìn)行治療，檢測(cè)模型小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的變化情況，以期為急性腎損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 EX224精密電子分析天平(美國(guó)OHAUS公司)；生化自動(dòng)分析儀(瑞士羅氏診斷有限公司)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；HWS-28恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；ST40 ST40R臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)thermo有限公司)；T10高速組織勻漿機(jī)(德國(guó)IKA有限公司)。

1.1.2 所需試劑 順鉑、N-乙酰半胱氨酸(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；生理鹽水(購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司)；PEP-1-SOD蛋白(購(gòu)自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Biovision公司)；血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組情況 清潔級(jí)(SPF)的10月齡雄性BALB/C小鼠購(gòu)自中科院生物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共計(jì)60只，體重(30±2)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有小鼠隨機(jī)分為3組，分別為治療組、損傷組和對(duì)照組，每組20只小鼠。

1.2 方法

1.2.1 急性腎損傷小鼠模型的建立 BALB/C小鼠在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后進(jìn)食15 h，腹腔注射20 mg/kg的順鉑，注射前使用生理鹽水將順鉑稀釋至濃度為1 g/L，腹腔注射3 d誘導(dǎo)AKI模型。

1.2.2 給藥方法 在建立AKI模型1周后，治療組小鼠腹腔注射100 mg/(kg·d)的N-乙酰半胱氨酸及500 μg/(100 g·d)的PEP-1-SOD蛋白進(jìn)行治療，連續(xù)給藥7 d，損傷組和對(duì)照組小鼠則注射等體積的生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.2.3 樣品獲得及處理 在誘導(dǎo)3 d后及治療后小鼠禁食禁水6 h，乙醚麻醉稱量小鼠體重，采取開胸心臟取血的方法取血1.0 ml，放置在4 ℃冰箱中靜置30 min，取出后加入至1 ml離心管中，以4 000 r/min離心10 min，使用移液器吸取血清留用。采血后打開小鼠腹腔，暴露膀胱并收集其中的尿液，暴露腹主動(dòng)脈，從小鼠腹主動(dòng)脈灌流冰預(yù)冷的PBS溶液，迅速取出雙腎并去除腎被膜，使用濾紙將腎表面的水分吸干后進(jìn)行稱重，腎臟指數(shù)=雙腎重(mg)/體重(g)。三組小鼠在建模后3 d取10只鼠的血和腎臟，其余10只在治療后取血和腎臟。

1.2.4 腎小管損傷評(píng)價(jià) 將三組小鼠腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋，然后使用切片機(jī)進(jìn)行病理切片，水化后進(jìn)行HE染色，由病理科兩位醫(yī)師在顯微鏡下觀察腎小管損傷情況，每張切片選擇10個(gè)視野。當(dāng)在顯微鏡下觀察到腎小管擴(kuò)張，刷狀緣脫落，空泡變性，節(jié)段性基底膜裸露，腎小管細(xì)胞壞死，則認(rèn)定為出現(xiàn)腎損傷。

腎損傷的嚴(yán)重程度評(píng)分按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：無(wú)損傷為0分；損傷≤10%為1分；損傷11%～25%為2分；損傷26%～45%為3分；損傷41%～57%為4分；損傷≥76%為5分。

1.2.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑盒檢測(cè)血清中Cr和BUN含量。

1.2.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取三組小鼠的腎組織，使用勻漿器進(jìn)行勻漿，采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)腎組織中SOD、MDA、GSH的水平。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腎臟損傷情況 結(jié)果顯示，治療組及損傷組小鼠治療前腎臟指數(shù)明顯低于對(duì)照組，治療組、損傷組及對(duì)照組小鼠治療后腎臟指數(shù)與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腎臟指數(shù)比較

治療組及損傷組小鼠治療前腎臟損傷程度評(píng)分明顯高于對(duì)照組，治療組小鼠治療后腎臟損傷程度評(píng)分與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，損傷組及對(duì)照組小鼠治療后腎臟損傷程度評(píng)分與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組小鼠腎臟損傷程度評(píng)分情況

2.2 小鼠生化指標(biāo)變化情況 治療組及損傷組小鼠治療前Cr及BUN的水平均明顯低于對(duì)照組，治療組小鼠治療后Cr及BUN水平較治療前均明顯升高(P<0.05)，損傷組及對(duì)照組治療后Cr及BUN水平與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

圖1 各組小鼠腎臟病理檢測(cè)

表3 各組小鼠血清相關(guān)生化指標(biāo)情況(mg/dl)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 小鼠治療前后體內(nèi)氧化應(yīng)激水平變化情況 治療組及損傷組小鼠治療前SOD水平均明顯低于對(duì)照組，治療組小鼠治療后SOD水平較治療前明顯升高(P<0.05)，而損傷組及對(duì)照組小鼠治療后與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎臟SOD水平比較(U/mg)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.001(*1t=12.344，*2t=5.051，*3t=12.391，*4t=14.457)；#與損傷組比較，P<0.001(t=8.885)

治療組及損傷組小鼠治療前MDA、GSH水平均明顯高于對(duì)照，治療組小鼠治療后MDA、GSH水平較治療前明顯降低(P<0.05)，而損傷組及對(duì)照組小鼠治療后與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5、表6。

表5 各組小鼠腎臟MDA水平比較(nmol/mg)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.001(*1t=12.902，*2t=4.121，*3t=13.520，*4t=13.124)；#與損傷組比較，P<0.001(t=7.724)

表6 各組小鼠腎臟GSH水平比較(nmol/mg)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.001(*1t=12.410，*2t=6.744，*3t=12.503，*4t=14.620)；#與損傷組比較，P<0.001(t=8.138)

3 討論

腎毒性在順鉑的不良反應(yīng)中出現(xiàn)的頻率最高，其他不良反應(yīng)還包括：骨髓抑制、耳毒性、胃腸道毒性和變態(tài)反應(yīng)[12-13]。研究表明，順鉑腎毒性的重要機(jī)制中包含氧化應(yīng)激的作用[14]。

在臨床祛痰藥物中，NAC出現(xiàn)的頻率很高。近年研究顯示，該藥物可作為氧化性的巰基供體影響細(xì)胞代謝作用，直接對(duì)自由基產(chǎn)生干擾和清除效果。故在臨床的診斷和實(shí)驗(yàn)中(如神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、呼吸、AIDS等方面[15])，均具有更大的應(yīng)用潛力。隨著研究的深入，NAC也得到研究者的重視，特別是其抗氧化和預(yù)防組織損傷作用。對(duì)于包含肝損傷的組織損傷研究中，也證明NAC存在抗氧化治療作用[16]，但是對(duì)于腎損傷的影響，出現(xiàn)很多差異較大的結(jié)論。如在抗腎損傷藥物中，NAC具有很大程度的臨床價(jià)值[17]，不過(guò)有的研究也得到完全相反的結(jié)論[18]。所以，對(duì)于腎臟功能的提升，需要對(duì)NAC進(jìn)行更為深入的探索和研究。

在減少細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷方面，SOD作為關(guān)鍵酶具有保護(hù)和清除自由基作用[19]。SOD1不僅是SOD的主要形式，在細(xì)胞中也是高水平表達(dá)的SOD。經(jīng)過(guò)人工合成的PEP-1具有很多較好特性，如對(duì)血清不敏感、安全、無(wú)毒、高效等。作為一種細(xì)胞穿透肽能以非能量、非受體依賴性的方式，對(duì)很多物質(zhì)產(chǎn)生作用，如蛋白質(zhì)、肽段、寡核苷酸等，能夠?qū)⑦@些物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)[20-21]。在銅-鋅超氧化物中存在一種由基因工程制備的歧化酶，即SOD1。其最主要的作用為降低O2-產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，該歧化反應(yīng)在O2-作用下進(jìn)行。但是大分子物質(zhì)在生物學(xué)應(yīng)用上存在很多限制因素，如不存在特異性受體和通道，內(nèi)吞作用也不能作為進(jìn)入細(xì)胞的方式。故通過(guò)基因技術(shù)的研究，產(chǎn)生PEP-1-SOD1融合的蛋白，該蛋白能通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入缺血/再灌注損傷的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

NAC是一種黏液溶解劑，作為臨床上常用的祛痰藥應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，而且具有抑制細(xì)胞凋亡的效果。PEP-1-SOD1具有直接且明顯的抗氧化應(yīng)激的效果，未見有研究采用PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC對(duì)順鉑誘導(dǎo)影響急性腎損傷小鼠后氧化應(yīng)激水平的相關(guān)研究。本研究采用PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠進(jìn)行治療，以期從降低氧化應(yīng)激水平和抗細(xì)胞凋亡水平對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠進(jìn)行雙方面保護(hù)，從而降低順鉑導(dǎo)致的急性腎損傷和氧化應(yīng)激水平，提高急性腎損傷小鼠治療效果。

本研究采用PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠模型進(jìn)行治療，PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC不但可以提高小鼠腎臟指數(shù)，降低小鼠腎臟損傷程度，并且可以提高體內(nèi)SOD水平，降低GSH、MDA水平，從而緩解機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的情況，降低機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。本研究為化療藥物順鉑所致急性腎損傷的治療、化療藥物的改進(jìn)提供了研究基礎(chǔ)及臨床依據(jù)。