不同時程嗎啡依賴對雄性大鼠睪丸GRP94和XBP-1表達的影響

耿娜娜，羅素元，鄭 翔，涂 平，余守洋，吳明松*

0 引言

嗎啡(Morphine，Mor)、海洛因等阿片類藥物的濫用，已成為全世界重點關注的醫(yī)學問題和社會問題。嗎啡成癮對機體多個器官如心臟、腎臟和睪丸等[1-3]及各系統(tǒng)如神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等[4-5]均有潛在的損害作用，其中，生殖系統(tǒng)是嗎啡損害的主要靶系統(tǒng)之一[6]。研究表明，嗎啡成癮會引起睪丸組織萎縮、誘導細胞凋亡發(fā)生或造成下丘腦-垂體-性腺軸功能的紊亂[7-9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中蛋白合成、加工等的重要場所，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積聚或細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，都會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulums stress，ERS)。ERS通路是介導細胞凋亡的主要通路之一，而IRE1-XBP-1(Inositol requiring enzyme l-X box binding protein-1)通路是ERS通路中最基礎、最保守的信號通路[10]。本課題組前期研究結(jié)果表明，雄性SD大鼠睪丸ERS參與了嗎啡成癮的過程，且與ERS標志性分子GRP78的激活有關[11]。但該機制是否與ERS標志性分子GRP94及其主要通路IRE1-XBP-1通路的激活有關，尚未闡明。因此，本文在前期研究的基礎上，進一步檢測嗎啡精神依賴大鼠睪丸組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(Glucose regulated protein 94，GRP94)及X-盒結(jié)合蛋白-1(X box binding protein-1，XBP-1)的動態(tài)表達，對嗎啡成癮狀態(tài)下睪丸的ERS調(diào)控機制進行深入探究，為嗎啡依賴導致的生殖系統(tǒng)損傷的預防、治療及藥物開發(fā)提供更多的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠(8周齡)，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證編號：SCXK(渝)2007-0005，體重120～140 g，分籠飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)房溫度24 ℃，通風良好，自然晝夜循環(huán)，大鼠自由進食和飲水。鹽酸嗎啡注射液購自沈陽第一制藥廠(規(guī)格：10 mg/ml，批號：TD2006-0028)，PCR引物由上海生工生物公司合成，Taq酶購自上海捷瑞生物工程有限公司，RNAiso TM Plus購自TaKaRa Biotechnology公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，鼠抗人GRP94單抗、鼠抗人GAPDH單抗及二抗均購自Protein-Tech Group公司，兔抗人XBP1多抗購自Santa-Cruz公司。條件性位置偏愛(Conditioned place preference，CPP)裝置參照Randall等[12]方法制作而成，其體積為60 cm×30 cm×30 cm，用隔板將CPP裝置分為相同體積的兩部分，一部分的內(nèi)壁為黑色，箱底較粗糙(黑箱)；另一部分的內(nèi)壁為白色，箱底較光滑(白箱)。

1.2 建立大鼠模型 將大鼠置于未放隔板的CPP箱中，使其自由穿梭(連續(xù)3 d，1次/d，15 min/次)，并記錄大鼠在黑白箱的時間，剔除對白箱或黑箱有明顯偏愛的大鼠，選取無明顯偏愛的大鼠96只,隨機分為2組，其中48只注射嗎啡(Mor組)，其余48只注射生理鹽水(NS組)。建模訓練：用隔板將黑白箱隔開，Mor組按照劑量遞增法(起始劑量為10 mg/kg，終止劑量為100 mg/kg)皮下注射嗎啡，NS組注射等量的生理鹽水。給藥20 min后，分別將Mor組、NS組大鼠置于白箱訓練40 min。末次訓練48 h后，再進行CPP測試，以確認嗎啡CPP模型建立成功。將Mor組大鼠隨機分為Mor戒斷組、Mor消退組和Mor點燃組；NS組大鼠隨機分為相應的對照組，即NS戒斷組、NS消退組和NS點燃組。其中，戒斷組：自然戒斷48 h，15 d后進行CPP測試，觀察戒斷狀態(tài)，直至Mor組CPP測試結(jié)果和NS組相當，可認為戒斷成功。消退組：13 d時停止給藥，30 d后進行CPP測試，直至大鼠對Mor的依賴消退。點燃組：大鼠對Mor的依賴消退后，于31 d給藥Mor(10 mg/kg)進行復燃。麻醉處死各組大鼠，取其睪丸組織。

1.3 RT-PCR 取大鼠的睪丸組織，采用Trizol法提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行PCR反應。引物：GRP94，F(xiàn):5′-AAGGTCATTGTCACGTCGAAA-3′，R:5′-GTGTTTCCTCTTGGGTCAGC-3′，產(chǎn)物長度為98 bp；XBP-1，F(xiàn):5′-AAACAGAGTAGCAGCACAGACTGC-3′，R:5′-TCCTTCTGGGTAGACCTCTGGGA-3′，產(chǎn)物長度為454 bp；GAPDH，F(xiàn):5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′，R:5′-GGTGGTGAAGA

GGCCAGTAG-3′，產(chǎn)物長度為305 bp。以cDNA為反應模板，建立總體積為10 μl的反應體系：1 μl cDNA，3 μl無菌水，0.5 μl 5′引物，0.5 μl 3′引物，5 μl Sso Fast Eva Green Supermix。建立反應程序：94 ℃ 60 s，95 ℃ 20 s，63.8 ℃(GRP94)或60.6 ℃(XBP-1)或56 ℃(GAPDH)30 s，40個循環(huán)周期。

1.4 Western blot 取大鼠的睪丸組織，裂解提取總蛋白，用BCA法測定其濃度。進行上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加入GRP94一抗(1∶1 000)、XBP-1一抗(1∶2 000)、GAPDH一抗(1∶10 000)，4 ℃下過夜，TBST溶液漂洗3次，分別加入二抗(1∶2 000)37 ℃下孵育1 h，TBST溶液漂洗5次，加ECL發(fā)光劑，于暗室中曝光顯影，拍照。采用IPP軟件分析Western blot條帶的灰度值，得出GRP94和XBP-1蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡戒斷、成癮消退和點燃對睪丸GRP94表達的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與NS對照組比較，嗎啡依賴大鼠戒斷48 h后，其睪丸組織GRP94 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)；經(jīng)17 d的戒斷，大鼠對嗎啡依賴消退后，睪丸組織GRP94 mRNA和蛋白表達水平均有所升高(P>0.05)；大鼠對嗎啡依賴消退后，于31 d給藥嗎啡進行復燃，睪丸組織GRP94 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)?？傮w來看，嗎啡依賴大鼠睪丸組織GRP94表達水平在戒斷48 h后最高，消退時有所降低(P<0.01)，而點燃后水平又有所上調(diào)(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 嗎啡戒斷、成癮消退和點燃后睪丸GRP94 mRNA表達的變化

圖2 嗎啡戒斷、成癮消退和點燃后睪丸GRP94蛋白表達的變化

2.2 嗎啡戒斷、成癮消退和點燃對睪丸XBP-1表達的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與NS對照組比較，嗎啡依賴大鼠戒斷48 h后，其睪丸組織XBP-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)；經(jīng)17 d的戒斷，大鼠對嗎啡依賴消退后，睪丸組織XBP-1 mRNA和蛋白表達水平均升高(P>0.05)；大鼠對嗎啡依賴消退后，于31 d給藥嗎啡進行復燃，睪丸組織XBP-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)?？傮w來看，嗎啡依賴大鼠睪丸組織XBP-1表達水平在戒斷48 h后最高，消退時有所降低(P<0.01)，而點燃后水平又有所上調(diào)(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 嗎啡戒斷、成癮消退和點燃后睪丸XBP-1 mRNA表達的變化

圖4 嗎啡戒斷、成癮消退和點燃后睪丸XBP-1蛋白表達的變化

3 討論

嗎啡是最早提取出來的生物堿物質(zhì)，分子式為C17H19NO3，具有止痛、抑制腸蠕動、鎮(zhèn)咳等多種藥理作用，但是嗎啡濫用會誘發(fā)多種不良反應，造成機體多種系統(tǒng)損害，其中睪丸結(jié)構(gòu)和功能損傷是其重要表現(xiàn)之一。研究表明，嗎啡依賴可導致大鼠睪丸生精管壁上皮細胞減少，精子數(shù)量降低，誘導睪丸支持細胞發(fā)生凋亡，促使睪丸組織萎縮或發(fā)生病變等[3,7]，但是其誘導睪丸細胞凋亡的具體分子機制尚未完全闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的細胞器，其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)揮的基礎條件。在缺氧、氧化應激、毒性物質(zhì)等的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)增加，當其超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的調(diào)節(jié)能力時，細胞會激活相關信號轉(zhuǎn)導反應，來適應外界環(huán)境的變化，并恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，即ERS；當ERS過載過久、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)能力降低時，細胞將啟動凋亡程序。研究發(fā)現(xiàn)，長久的ERS能夠誘導生精細胞凋亡的發(fā)生，如輻射、NaF等均可通過激活睪丸細胞的ERS[13-15]，促進其發(fā)生細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP94是ERS的標志性分子之一。ERS發(fā)生時，大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，GRP94的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平升高，可結(jié)合未折疊的多肽鏈，從而促進蛋白質(zhì)的正確折疊。XBP1是ERS中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子。正常生理狀態(tài)下，XBP1 mRNA編碼少量轉(zhuǎn)錄活性低的轉(zhuǎn)錄因子；發(fā)生ERS時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激活轉(zhuǎn)錄因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)和IRE1首先被激活，活化后的ATF6可促進XBP1 mRNA表達水平升高，產(chǎn)生大量未剪接的XBP1，并在IRE1的作用下剪接，剪接后的XBP1 mRNA能夠編碼大量高活性的XBP1轉(zhuǎn)錄因子，使XBP1表達水平上調(diào)。本課題組前期研究結(jié)果表明，雄性SD大鼠睪丸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡通路參與了嗎啡成癮過程，且與GRP78分子的激活有關[11]，但ERS標志性分子GRP94及其主要通路IRE1-XBP-1通路，是否也參與了嗎啡成癮誘導的大鼠睪丸ERS過程，尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，與NS對照組比較，嗎啡依賴大鼠戒斷48 h后，其睪丸組織GRP94 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高；經(jīng)17 d的戒斷，大鼠對嗎啡的依賴消退后，其睪丸組織GRP94 mRNA和蛋白表達水平均有所升高；大鼠對嗎啡依賴消退后，于31 d再給予嗎啡進行復燃，其睪丸組織GRP94 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，表明ERS標志性分子GRP94及其主要通路IRE1-XBP-1通路，也參與了嗎啡成癮誘導的大鼠睪丸ERS過程。此外，長期用藥之后，當減少、中斷用藥或服用某些拮抗劑，機體會出現(xiàn)生理功能的紊亂，稱之為戒斷綜合征，該綜合征通常在停藥后8～12 h出現(xiàn)，36～72 h到達頂峰，7～12 d逐漸緩解或消失，如吸毒者在戒斷毒品后的24～48 h內(nèi)，急性戒斷綜合征表現(xiàn)最為明顯。本研究顯示，睪丸組織GRP94和XBP1在嗎啡依賴大鼠戒斷48 h后，表達水平最高，嗎啡依賴消退時有所降低，而點燃后二者的表達水平又顯著上調(diào)，其機制可能是由于在嗎啡依賴急性戒斷期時，機體處于應激狀態(tài)，應激水平較高，ERS水平也較高；進入消退期后，應激水平下降，ERS水平也隨之降低；而嗎啡成癮復燃后，機體又恢復較強的應激狀態(tài)，ERS水平又有所上調(diào)，如此反復的復吸，促使睪丸細胞一直處于較高的ERS水平，誘導睪丸細胞凋亡的發(fā)生，最終導致睪丸及生殖系統(tǒng)等發(fā)生不可逆性的損傷。

綜上所述，本研究進一步證實了嗎啡依賴與睪丸ERS存在一定的關聯(lián)，并且與睪丸ERS標志性分子GRP94及其XBP-1通路的激活密切相關，為嗎啡等阿片類藥物依賴患者生殖系統(tǒng)損傷修復提供了更多的理論依據(jù)。