TGF-β1誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)口腔鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移

，棟梁， ，

(重慶涪陵中心醫(yī)院燒傷整形科， 重慶 408000)

口腔癌發(fā)病率位居頭頸部惡性腫瘤首位，占人類惡性腫瘤發(fā)病率的3%，全球每年平均新增10萬例新患者[1]。口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是具有不同程度鱗狀分化的上皮侵襲性腫瘤，約占所有類型口腔癌總數(shù)的90%[2]。目前針對口腔鱗癌的治療以手術(shù)、放化療相結(jié)合的個體化綜合療法為主，但仍有較多患者在綜合治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其5年生存率僅為50%[2]。因此，深入探究口腔鱗狀細(xì)胞癌遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制十分有必要。惡性腫瘤在生長過程中逐漸產(chǎn)生全身遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的過程，受到多種因素在多個不同階段的序貫調(diào)控。近年來，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，這一過程與惡性腫瘤的遠(yuǎn)處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT是指細(xì)胞在某些特殊的生理、病理生理條件下，受到內(nèi)源性或外源性刺激，使得上皮細(xì)胞失去其上皮特征，并逐漸獲得間質(zhì)特性的過程[3-4]。上皮細(xì)胞喪失原本存在的極性、進(jìn)而解除與周圍細(xì)胞之間的連接并與細(xì)胞基質(zhì)的接觸減少、細(xì)胞骨架改變，同時伴隨著細(xì)胞遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)，這些都是EMT的特征性變化。EMT不僅參與胚胎早期發(fā)育和器官生成，同時也通過促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移從而參與許多惡性上皮腫瘤發(fā)展的過程[5]。

轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)是一種被證實能夠被不同細(xì)胞分泌的有著廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，不僅在細(xì)胞的分裂與增殖過程中發(fā)揮重要作用，而且與新生血管形成和惡性腫瘤的發(fā)生等過程緊密相關(guān)[6-7]。此外，研究表明TGF-β信號通路的異常激活也參與了EMT 過程[8-9]。然而在具有高度侵襲性的口腔鱗癌中，EMT是否參與其遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移過程，以及TGF-β1在這一生物學(xué)事件中的調(diào)控作用目前鮮有報道。本文旨在研究TGF-β1誘導(dǎo)人口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞發(fā)生EMT及對細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 材料

人口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；TGF-β1購自R&D公司；TGF-β1抑制劑LY2109761購自Selleck公司；TRIzol RNA 提取試劑購自Takara 公司；本研究所有PCR引物的設(shè)計與合成均委托上海擎科生物公司完成；多克隆兔抗人E-cadherin、Vimentin、GAPDH一抗購自美國Santa Cruz公司；辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司； Protein marker 購自Thermo Fisher公司；ECL 發(fā)光試劑盒購自Millipore公司；小牛血清購自GIBCO 公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HYCLONE公司；24孔transwell小室(孔徑8 μm)購自Corning Costar公司；細(xì)胞基質(zhì)膠(Matrigel)購自BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Tca8113細(xì)胞株在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10%小牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素、RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底60%后，改換用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理(6～8 h)，再加入TGF-β1處理24 h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將長滿的Tca8113細(xì)胞消化、傳代種于6孔板，待其貼壁后用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓處理6～8 h。第二日使用TGF-β1對細(xì)胞處理48 h后在普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀測Tca8113細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.4 RNA 提取和real-time PCR 檢測

使用冰上預(yù)冷PBS洗滌將處理完成的細(xì)胞洗滌3次，隨后每個孔分別加入1 mL Trizol溶液，提取細(xì)胞總RNA為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。PCR 所用引物由上海擎科生物科技公司上海分公司合成，引物序列如下：GAPDH 上游引物5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，下游引物5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ ； Vimentin 上游引物5’-CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC-3’，下游引物5’-GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA-3’ ；E-cadherin 上游序列5’-GTACTTGTAATGACACATCTC-3’；下游引物5’-TGCCAGTITCTGCATCTGC-3’。反應(yīng)條件均為95 ℃、3 min 預(yù)變性；94 ℃、30 s ；48 ℃、30 s，72 ℃、1 min，擴(kuò)增35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 Western blot檢測

將已處理好的口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系用PBS洗滌3次隨后加入RIPA裂解液并用細(xì)胞刮刀刮下來放入1.5 mL EP管中冰上裂解30 min。隨后于12 000 r/min離心10 min并將蛋白上清液凍存于-20 ℃。使用 5×蛋白上樣緩沖液混勻蛋白上清后于95 ℃中加熱10 min，待其充分變性。上機(jī)跑電泳，隨后轉(zhuǎn)膜并置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。封閉結(jié)束后使用TBST洗膜5 min×3次，隨后將膜置于多克隆兔抗人的GAPDH、Vimentin、E-cadherin(濃度均為1∶1 000)中4 ℃孵育過夜。次日，洗膜5 min×3次后，置于辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG中室溫孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法金鼎顯影。應(yīng)用Quantity One軟件分析條帶灰度值并作統(tǒng)計分析。

1.6 細(xì)胞遷移與侵襲實驗

將Matrigel膠 (matrigel原液與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3)鋪在小室上面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中待用。將口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系在無血清RMPI-1640培養(yǎng)基中饑餓處理6 h后，將其消化、重懸，上室加入無血清細(xì)胞懸液200 μL(細(xì)胞量4×105/mL)，下室加入含20%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基，每孔600 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。處理完成后取出小室，用PBS洗滌3次，并用濕棉簽輕柔擦除上室面的細(xì)胞，隨后置于4%多聚甲醛中固定20 min。取出室溫下風(fēng)干3～5 min，隨后置于結(jié)晶紫染料中染色15 min。最后用PBS洗滌3次，并置于倒置顯微鏡下觀察穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1促進(jìn)上皮樣Tca8113細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化

Tca8113 細(xì)胞經(jīng)過10 ng/mL濃度TGF-β1刺激24 h 后，在普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀察拍照發(fā)現(xiàn)，Tca8113細(xì)胞在對照組中形態(tài)為典型的上皮樣結(jié)構(gòu)，而經(jīng)10 ng/mL TGF-β1處理的Tca8113細(xì)胞大部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧?xì)長梭形，呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài) (圖1)。

a：空白對照組(0 ng/mL TGF-β1)；b: TGF-β1處理組(10 ng/mL TGF-β1)；c: TGF-β1+TGF-β1 siRNA組(10 ng/mL TGF-β1+LY2109761)

圖1Tca8113細(xì)胞經(jīng)10ng/mL濃度TGF-β1處理24h后的形態(tài)學(xué)變化(×400)

2.2 TGF-β1對Vimentin、E-cadherin mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)過不同濃度(0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL)TGF-β1處理24 h后，RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1刺激后Tca8113細(xì)胞TGF-β1處理組的上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin mRNA表達(dá)量隨藥物濃度的增加而下降，而間質(zhì)標(biāo)記蛋白Vimentin mRNA的表達(dá)量卻隨藥物濃度的增加而逐步增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

a:E-cadherin mRNA相對表達(dá)量;b:Vimentin mRNA相對表達(dá)量 *：與0 ng/mL TGF-β1比較，P<0.05；**：與0 ng/mL TGF-β1比較，P<0.01

圖2Tca8113細(xì)胞經(jīng)不同濃度TGF-β1處理24h后E-cadherin和VimentinmRNA的表達(dá)量

2.3 TGF-β1對Vimentin、E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響

不同濃度(0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL)TGF-β1處理Tca8113 細(xì)胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示TGF-β1刺激后，Tca8113細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)量隨TGF-β1濃度的增加而下降，而間質(zhì)標(biāo)記蛋白Vimentin的表達(dá)量卻隨TGF-β1濃度的增加相應(yīng)增加, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 TGF-β1抑制劑逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

使用10 ng/mL TGF-β1處理處理Tca8113 細(xì)胞24 h后，與對照組相比，上皮表型E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，間質(zhì)表型Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而加用10 ng/mL濃度TGF-β1抑制劑LY2109761則顯著逆轉(zhuǎn)這EMT現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5 TGF-β1促進(jìn)Tca8113 細(xì)胞遷移

在Transwell小室遷移實驗中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理24 h后，與對照組相比TGF-β1處理組中Tca8113細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而加用TGFβ1特異抑制劑LY2109761能夠逆轉(zhuǎn)這一過程，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

2.6 TGF-β1促進(jìn)Tca8113 細(xì)胞侵襲

在Transwell小室遷移實驗中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理24 h后，與對照組相比TGF-β1處理組中Tca8113細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而加用TGFβ1特異抑制劑LY2109761能夠逆轉(zhuǎn)這一過程，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，具有惡性程度高、局部生長迅速、晚期易于侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等生物學(xué)特點[10-12]。惡性腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移過程受到多基因、多因素互相調(diào)控，包括以下幾個階段：腫瘤細(xì)胞首先從原發(fā)病脫離，隨后隨著血液循環(huán)到遠(yuǎn)處定植生長成為轉(zhuǎn)移灶，在這個過程中其是通過局部浸潤、血行轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖等步驟來序貫實現(xiàn)的[13-15]。如何早期發(fā)現(xiàn)和阻斷該腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及應(yīng)用有效的治療方法是預(yù)防與治療口腔鱗癌的關(guān)鍵所在。

a:Wester blot檢測E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá);b:E-cadherin相對表達(dá)量;c:Vimentin相對表達(dá)量 *:與0 ng/mL TGF-β1處理組比較，P<0.05;**:與0 ng/mL TGF-β1處理組比較，P<0.01

圖3Tca8113細(xì)胞經(jīng)不同濃度TGF-β1處理24h后E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)量

a:Wester blot檢測E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá);b:E-cadherin相對表達(dá)量;c:Vimentin相對表達(dá)量 *：P<0.05；**：P<0.01

a：空白對照組；b: TGF-β1處理組；c: TGF-β1+LY2109761組；d: TGF-β1+TGF-β1 siRNA組

a：空白對照組；b: TGF-β1處理組；c: TGF-β1+LY2109761組；d: TGF-β1+TGF-β1 siRNA組

越來越多的研究結(jié)果表明，EMT 廣泛參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移生物學(xué)過程，包括乳腺癌、宮頸癌、肝癌、結(jié)腸等[16-18]。Greenburg等[19]在實驗中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的上皮來源細(xì)胞逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，在這一基礎(chǔ)上首次證實EMT的發(fā)生。 EMT在胚胎和器官的發(fā)育、多種纖維化疾病以及惡性腫瘤發(fā)病等過程中都發(fā)揮著重要作用。目前，口腔鱗狀細(xì)胞癌中的EMT 研究報道較少。有學(xué)者使用免疫組織化學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中EMT相關(guān)指標(biāo)snail和Slug呈高表達(dá)，而上皮表型E-cadherin呈低表達(dá)，并且snail、slug與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，而與患者的預(yù)后成正相關(guān)[20-22]。Krisanaparkornkit等[23]采用Western blot和明膠酶譜法分別檢測不同類型口腔鱗癌細(xì)胞株(HN008、HN5 和HN6、HN15)中EMT與侵襲相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況，在多種細(xì)胞株中檢測到E-cadherin、MMP-9的表達(dá)下調(diào)和Vimentin、MMP-2的表達(dá)上調(diào)。整合素尤其是αVβ6 整合素在EMT中起重要作用，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中完整的β6 亞基能夠誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，上調(diào)vimentin的表達(dá)，減少cytokeratin和E-cadherin的表達(dá)，而表達(dá)不完整β6亞基的口腔鱗癌細(xì)胞能夠保持其上皮特性并不改變vimentin或E-cadherin的表達(dá)[24]。以上研究證實EMT參與了口腔鱗癌的發(fā)病過程，但是口腔鱗癌中EMT程序是如何啟動的及其對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能有何影響，目前鮮有報道。

TGF-β1是TGF-β超家族的重要成員之一，是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子, 對細(xì)胞侵襲、凋亡、衰老以及分化等重要的生理過程進(jìn)行調(diào)節(jié)[25-26]。EMT 的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，涉及眾多分子和信號通路, TGF-β1信號通路在EMT的啟動和發(fā)展過程中作為主要誘導(dǎo)劑發(fā)揮關(guān)鍵作用[27-28]。多個系列研究證明，TGF-β信號通路的異常激活是惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子[29]。腫瘤細(xì)胞內(nèi)經(jīng)?？蓹z測到活化TGF-β 的產(chǎn)生增加；這不僅觸發(fā)EMT程序的啟動、增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移能力，而且也與腫瘤微環(huán)境局部的新生毛細(xì)血管形成有關(guān)，后者可為發(fā)生遷移的腫瘤間質(zhì)細(xì)胞提供營養(yǎng)支持[30-31]。由于TGF-β 引發(fā)的EMT 針對不同類型的上皮細(xì)胞具有不同的特點，因此，TGF-β 誘導(dǎo)EMT 發(fā)生的機(jī)制在不同的腫瘤發(fā)生過程中確實存在著差異。目前關(guān)于TGF-β1能否誘導(dǎo)人口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞發(fā)生EMT，尚未見報道。因此，基于以上研究發(fā)現(xiàn)，我們推測TGF-β1通過誘導(dǎo)人口腔鱗癌Tca8113 細(xì)胞EMT的發(fā)生，使其侵襲轉(zhuǎn)移增加，導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

在本項研究中，我們首先驗證了TGF-β1是否能夠誘導(dǎo)Tca8113 細(xì)胞EMT的發(fā)生。結(jié)果表明，使用10 μg/L TGF-β1處理24 h后，大部分Tca8113細(xì)胞的形態(tài)與對照組相比明顯拉長呈長梭形，呈現(xiàn)散在生長狀態(tài)。這一結(jié)果表明TGF-β1能夠誘導(dǎo)典型的EMT的發(fā)生。在EMT發(fā)生時，E-cadherin 作為上皮間黏附的主要標(biāo)記蛋白其表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)表型蛋白vimentin的上調(diào)使細(xì)胞相互之間的黏附力下降，使細(xì)胞的運(yùn)動能力明顯增強(qiáng)，進(jìn)而引起局部腫瘤細(xì)胞向外周浸潤生長及轉(zhuǎn)移。接下來我們在mRNA和蛋白水平分別驗證受TGF-β1刺激的Tca8113細(xì)胞是否發(fā)生EMT。經(jīng)過不同濃度(0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL)TGF-β1處理24 h后，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示5 ng/mL濃度的TGF-β1處理24 h后，Tca8113細(xì)胞E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平最低，而Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平最高，這一結(jié)果表明TGF-β1成功誘導(dǎo)Tca8113 細(xì)胞EMT的發(fā)生。在證實TGF-β1的確能夠啟動EMT程序之后，我們在此基礎(chǔ)上采用Transwell小室實驗檢測Tca8113細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。經(jīng)過5 ng/mL濃度TGF-β1處理24 h后，TGF-β1處理組Tca8113細(xì)胞體外遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng)，而TGF-β1抑制劑LY2109761則有效減弱這一效應(yīng)。這一結(jié)果進(jìn)一步證實TGF-β1通過啟動EMT程序進(jìn)而促進(jìn)Tca8113細(xì)胞的體外遷移與侵襲能力。本研究存在以下不足之處：①驗證了TGF-β1誘導(dǎo)的口腔臨床細(xì)胞癌EMT，但TGF-β1調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌EMT發(fā)生的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。有研究表明在乳腺癌中能夠促進(jìn)ZEB1 和ZEB2 的表達(dá)，抑制E-cadherin 的表達(dá)。同時沉默這兩種轉(zhuǎn)錄因子能完全抵消TGF-β1對E-cadherin的抑制作用，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白，如N-cadherin和Vimentin則不受ZEB1和ZEB2沉默的影響。因此，在后續(xù)研究中我們將針對TGF-β1對EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用做進(jìn)一步研究；②只應(yīng)用一種細(xì)胞系來進(jìn)行驗證，在后續(xù)的深入研究中我們將采用兩種以上的細(xì)胞系來進(jìn)行實驗，使研究結(jié)果更有說服力。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在口腔癌Tca8113細(xì)胞系中TGF-β1能夠啟動EMT程序，從而顯著促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移能力，這為口腔鱗癌的高侵襲性提供新的理論支持。因此，深入研究EMT在口腔鱗癌發(fā)病中的作用機(jī)制，通過干預(yù)以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程，削弱惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能，這將為口腔鱗癌的個體化治療提供新的思路和依據(jù)。