MyoD在不同發(fā)育階段小鼠心肌的表達(dá)定位

薛霖莉，冀云燕，郝曉靜，曹靖，任華偉，李藝?yán)?，耿建軍，王海東，赫曉燕*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院，山西 太谷 030801；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)系，北京 102442)

MyoD基因是MRFs(myogenic regulator factors)基因家族的一個調(diào)控因子，截至目前MRFs基因家族共有4個成員：生肌決定因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(MyoG)和生肌調(diào)節(jié)因子5(Myf5)、生肌調(diào)節(jié)因子4(MRF4/Myf6)[1]。MyoD基因控制著肌細(xì)胞的增殖分化[2]是肌肉成長過程中最早開始表達(dá)的基因，MyoD基因在肌肉整個生長過程中都在發(fā)揮著作用,且肌肉分化末期表達(dá)量達(dá)到最高。MyoD基因作用的過程是與家族成員以及其它調(diào)節(jié)因子相互協(xié)同完成，以達(dá)到對肌肉發(fā)育精確調(diào)控[3]。

生肌調(diào)節(jié)因子家族，目前已知的4種調(diào)節(jié)因子都屬于磷酸蛋白類。它們共同的結(jié)構(gòu)都是含有氨基酸組成的高同源片段，該片段里已證實有70個殘基組成，顯堿性的精氨酸和賴氨酸形成堿性區(qū)，大約6個保守氨基酸構(gòu)成螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(bHLH：basic helix loop helix)結(jié)構(gòu)。堿性區(qū)是基因的啟動子或增強(qiáng)子的結(jié)合部位；bHLH結(jié)構(gòu)是一個保守結(jié)構(gòu)，其它調(diào)控因子家族也含有該結(jié)構(gòu)，對于基因結(jié)合起著介導(dǎo)作用，在生物體的生長發(fā)育調(diào)控中具有著極其重要的地位[3]。MRFs基因家族是機(jī)體通過反式激活作用來調(diào)控肌肉表達(dá)的，主要發(fā)揮作用的位點在MRFs基因的堿性區(qū)，bHLH結(jié)構(gòu)是發(fā)揮作用的前提。bHLH結(jié)構(gòu)正好形成二聚體且4個螺旋平行排列時，堿性區(qū)才能結(jié)合DNA發(fā)揮作用，MRFs基因才能表達(dá)調(diào)控[1]。

MyoD基因的表達(dá)調(diào)控是目前研究的熱點，Davis等[4]在1987年首次克隆出MyoD基因，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)τ诠趋兰〉姆只苤匾?，在組織修復(fù)方面不可或缺；1988年和1999年Braun等和Weintraub等人運用雜交的方法將MyoD基因定位在人的11號染色體上，隨后又在小鼠上定位至1號染色體上；1990年，Weintraub等通過結(jié)構(gòu)比對的方法找出了MRFs家族的另外家族成員[5]。MyoD基因在心肌中的表達(dá)定位以及對心肌分化發(fā)育中調(diào)控作用目前研究很少，本試驗通過選取幼年、性成熟、體成熟、老年4組小鼠進(jìn)行心肌MyoD基因的表達(dá)定位進(jìn)行研究，以期闡釋MyoD基因表達(dá)與心肌分化發(fā)育的相關(guān)性[6]，為進(jìn)一步研究肌肉作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

不同發(fā)育階段的小鼠共12只(由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心提供)，分別為幼齡小鼠(1周齡)3只，性成熟小鼠(3～4周齡)3只，體成熟小鼠(8周齡)3只和老齡小鼠(12月齡)3只。

1.2 試驗主要儀器和試劑

主要儀器：組織包埋機(jī)、烤片機(jī)、組織切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、普通PCR儀(Bio-rad；美國)、XB70制冰機(jī)(格蘭特儀器廠；寧波)、高速冷凍離心機(jī)(sigma；德國)、PCR電泳儀(六一儀器廠；北京)、凝膠成像系統(tǒng)(Panasonic)、超凈工作臺(SW-CJ-CO型；蘇州)。

主要試劑：固定液、酒精、二甲苯、中性樹脂、蘇木精、伊紅、蒸餾水、瓊脂粉、異丙醇、氯仿、PBS緩沖劑、免疫組織化學(xué)試劑盒、飽和苦味酸、冰醋酸、甲醛、顯色劑(DAB/AEC)、SYBR、ROX、RNAiso。

2 試驗方法

2.1 取樣

手術(shù)摘除取幼年鼠、性成熟鼠、體成熟鼠和老年鼠心臟，取部分組織置于Bouins氏固定液中室溫固定24 h，進(jìn)行固定用于制作石蠟切片，隨后進(jìn)行HE染色和免疫組化，部分組織于液氮中進(jìn)行保存，用于總RNA的提取。

2.2 總 RNA 的提取及 cDNA 的合成

采用Trizol 法對小鼠心肌組織總 RNA進(jìn)行提取，通過瓊脂糖電泳鑒定其完整性。 心肌組織 cDNA 合成采用 QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN公司生產(chǎn))進(jìn)行，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 瓊脂糖凝膠電泳及實時熒光定量

使用 primer premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計,引物序列結(jié)果見表 1。以β-actin作為內(nèi)參，以cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

2.4 qRT-PCR 的擴(kuò)增

表1目的基因及內(nèi)參基因引物序列

Table1 Objective gene and reference gene primer sequence

目的/基因Target/gene引物序列(5’-3’)Primer sequence退火溫度/℃Annealing temperatureMyoDβ-actinF:GACAGGGAGGAGGGGGTAGAGR:TGCTGTCTCAAAGGAGCAGAF:CGTTGACATCCGTAAAGACR:GGAGCCAGGGCAGTAA6060

qRT-PCR以β-actin為內(nèi)參，采用 QuantiFast SYBR Green PCR Kit，QIAGEN 公司產(chǎn)品進(jìn)行，實時熒光定量PCR儀對目的基因MyoD進(jìn)行實時熒光定量PCR，檢測該基因在4個階段小鼠骨骼肌中的表達(dá)情況。qRT-PCR每組樣本3個生物學(xué)重復(fù)。運用擴(kuò)增曲線CT值計算(計算公式為：2-△△ CT)。

2.5 石蠟組織切片的制作與HE染色

將心肌組織樣放入Bouins液固定防止分解，用梯度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。浸蠟2.5 h后進(jìn)行包埋。使用切片機(jī)上將組織快切成6 μm薄片。用二甲苯進(jìn)行脫蠟，再經(jīng)由高到低梯度酒精，蒸餾水洗滌，進(jìn)行蘇木精、伊紅染色，染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明后用中性樹膠封片。

2.6 免疫組織化學(xué)染色

將已經(jīng)包埋的石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、恒溫箱孵育、PBS沖洗、進(jìn)行封閉(5%山羊血清)、恒溫箱孵育、滴加目的兔抗多克隆抗體(4 ℃過夜)、37 ℃ 復(fù)溫、PBS 緩沖溶液沖洗、滴加HRP-山羊抗兔二抗工作液、孵育、PBS 緩沖溶液沖洗、DAB顯色、PBS 緩沖溶液、蘇木素輕度復(fù)染等步驟，使用中性樹膠進(jìn)行封片后在顯微鏡下觀察。

2.7 圖像及實驗數(shù)據(jù)分析

用Step one軟件收集實時熒光定量PCR的數(shù)值，并進(jìn)行處理和分析；在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色以及免疫組織化學(xué)實驗的切片，運用P Controller軟件進(jìn)行照片采集。

3 結(jié)果和分析

3.1 電泳結(jié)果及分析

對組織中MoyD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，其電泳結(jié)果如圖1所示，與Marker相比可以看出，產(chǎn)物條帶單一，且清晰，表明心肌組織中有MoyD基因表達(dá)。溫度為60 ℃擴(kuò)增的第四泳道條帶最清晰，在后續(xù)的實時熒光定量PCR中，退火溫度的設(shè)置以此試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 不同退火溫度下條帶的清晰度Fig.1 Definition of strips at different annealing temperature注：“M”Marker;“1”：MyoD基因57 ℃時擴(kuò)增產(chǎn)物; “2”：MyoD基因58 ℃時擴(kuò)增產(chǎn)物; “3”：MyoD基因59 ℃時擴(kuò)增產(chǎn)物;“4”：MyoD基因60 ℃時擴(kuò)增產(chǎn)物。Note:"1":MyoD gene amplification product at 57 ℃; "2":MyoD gene amplification product at 58 ℃; "3":MyoD gene amplification product at 59 ℃; "4":MyoD gene amplification product at 60 ℃.

3.2 實時熒光定量PCR結(jié)果

MyoD基因擴(kuò)增動力學(xué)曲線圖表明退火溫度為60 ℃，30 s，延伸溫度為72 ℃，20 s, 40擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)為PCR擴(kuò)增條件，不同發(fā)育階段MoyD基因模板開始起峰的時間有差異。溶解曲線波峰一致，表明引物特異性良好(圖2)。

圖2 實時熒光定量PCR結(jié)果Fig.2 Real-time fluorescence quantitative PCR results

對不同發(fā)育階段的小鼠進(jìn)行實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:MyoD基因在幼年鼠中mRNA的相對表達(dá)量為性成熟鼠的7.9倍，差異極顯著(P<0.01)，體成熟后表達(dá)量僅為性成熟鼠的0.3倍，差異顯著(P<0.05)，老年鼠為性成熟鼠的0.5倍，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，隨著成熟細(xì)胞的增多，相對表達(dá)量呈急劇下降趨勢，體成熟后表達(dá)量最低，老年鼠表達(dá)量會略有升高。表明MyoD基因可能與心肌的成熟發(fā)育相關(guān)(圖3)。

圖3 MyoD基因在不同時期小鼠心肌中的表達(dá)Fig.3 Expression of MyoD gene in myocardium of mice at different stages 注：“***≤0.001差異極顯著”。Note：“***”≤0.001The difference is extremely significant.

3.3 HE染色的結(jié)果

取小鼠心肌組織進(jìn)行組織包埋，制作切片后進(jìn)行HE染色,結(jié)果如圖4所示：A圖可見幼年鼠細(xì)胞核密集，可見較多中央核，心肌細(xì)胞呈短桿狀，由B、C圖可見性成熟鼠，體成熟鼠細(xì)胞呈束狀排列，心肌纖維中出現(xiàn)明暗相間的橫紋，很難見中央核，由D圖可見老年鼠心肌纖維排列紊亂，偶見中央核。

圖4 小鼠不同發(fā)育階段的HE染色結(jié)果Fig.4 HE staining results of different developmental stages in mice注：A.幼年組 B.性成熟組 C.體成熟組 D.老年組。Note:A. juvenile group B. sexual maturation group C.body maturation group D senile group.

3.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果

對不同發(fā)育階段小鼠心肌MyoD進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果如圖5所示，MyoD在不同發(fā)育階段小鼠的心肌組織免疫反應(yīng)陽性物定位于心肌纖維細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)中，在幼年小鼠中表達(dá)量最高，性成熟、體成熟、老年鼠中MyoD表達(dá)量均低于幼年鼠。其中性成熟小鼠表達(dá)量高于體成熟小鼠和老年小鼠，體成熟小鼠表達(dá)量最低。陰性對照切片，以PBS代替一抗，未見特異性著色。

圖5 不同發(fā)育階段的小鼠的免疫組織化學(xué)結(jié)果Fig.5 Immunohistochemical results of different developmental stages in mice 注：A、a：幼年組陽性、陰性結(jié)果；B、b：性成熟組陽性、陰性結(jié)果；C、c：體成熟組陽性、陰性結(jié)果；D、d：老年組陽性、陰性結(jié)果。Note:A、a：positive and negative results in juvenile group；B、b：Positive and negative results in sexual maturation group；C、c：Positive and negative results of body maturation group；D、d:Positive and negative results in the elderly group.

4 討論

MyoD是一種在體內(nèi)和體外表達(dá)于骨骼肌和某些肌肉細(xì)胞系中的核磷酸化蛋白，它通過一種與蛋白家族具有同源性的結(jié)構(gòu)域來將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞[7]。MyoD是一種骨骼肌特異性蛋白，也是肌發(fā)生的主調(diào)節(jié)基因，能夠誘導(dǎo)多種分化細(xì)胞類型的肌發(fā)生[4，8]。骨骼肌的形成需要MyoD，是檢測骨骼肌成肌細(xì)胞所必需的[9]。同時MyoD也是成肌細(xì)胞的啟動基因[10]，該基因家族與肌細(xì)胞的增值分化有著密切關(guān)系。本試驗探究MyoD在不同發(fā)育階段小鼠心肌的表達(dá)定位。結(jié)果顯示，MyoD在小鼠的不同發(fā)育階段心肌上均有表達(dá)，其中在幼年階段心肌上的表達(dá)最顯著，而在性成熟階段、體成熟階段的表達(dá)降低，老年階段表達(dá)稍有回升，且差異顯著，MyoD表達(dá)量與小鼠心肌細(xì)胞的發(fā)育具有相關(guān)性。

MyoD基因家族的結(jié)構(gòu)較為清楚，在骨骼肌的發(fā)育過程中起著重要的作用[11],已將該基因運用于各類動物的研究中。Weintraub等人在神經(jīng)、脂肪、肝臟和成纖維細(xì)胞系中觀察到的肌肉特異性基因MyoD的表達(dá)[12]。與此一致的是，Weinberg探究斑馬魚MyoD基因的分離試驗中發(fā)現(xiàn)，在野生型胚胎中MyoD在早期的開始表達(dá)[13]，從中胚期延伸到梭形體形成前，軸向中胚層直接相鄰的細(xì)胞表達(dá)該基因。在體細(xì)胞的形成和成熟過程中，每個體細(xì)胞的特定區(qū)域都有表達(dá)。Michelson對于分離出在果蠅胚胎發(fā)育過程中MyoD基因表達(dá)的研究表明MyoD基因在肌肉早期發(fā)育中的重要作用,即MyoD在果蠅胚胎中的表達(dá)預(yù)示著肌肉的形成[14,15]，得出其編碼與脊椎動物肌源性調(diào)節(jié)基因家族的序列相似性。MyoD對于肌肉的形成有重要的作用，尤其是在胚胎發(fā)育早期。

Megeney等人通過研究MyoD基因?qū)趋兰〕杉〖?xì)胞功能的影響，結(jié)果表明MyoD對于肌肉再生具有重要意義[16～18]。與我們研究結(jié)果一致的是MyoD突變使得肌細(xì)胞數(shù)量增加，這些肌細(xì)胞具有正常的體外分化潛能。損傷后，MyoD突變體再生能力嚴(yán)重降低[19,20]。這可能是造成小鼠心肌MyoD表達(dá)老年期稍有回升的原因。MyoD在不同發(fā)育階段小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)存在差異性，可以作為判斷肌細(xì)胞發(fā)育程度的一種指標(biāo)，為進(jìn)一步研究肌肉作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

5 結(jié)論

本研究檢測了不同生長發(fā)育階段小鼠心肌MyoD的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在不同發(fā)育階段的小鼠心肌纖維細(xì)胞胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)，幼年鼠表達(dá)量最高，性成熟鼠、體成熟鼠和老年鼠均低于幼年鼠，老年鼠表達(dá)量稍有回升，推測MyoD表達(dá)量變化與小鼠心肌細(xì)胞的發(fā)育具有相關(guān)性。