培養(yǎng)環(huán)境條件對花魔芋花粉萌發(fā)的影響

覃劍鋒，段龍飛，蔡陽光，郭邦利，陳國愛，劉次鵬

(陜西省安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 安康 725021)

魔芋屬天南星科 (Araceae) 魔芋屬 (AmorphophallusBlume)多年生草本植物，是一種富含葡甘聚糖且應(yīng)用價值較高的作物。主要分布在亞洲、非洲地區(qū)[1]，我國也是其原產(chǎn)國之一，多分布于南方各省山地丘陵區(qū)[2]。目前，魔芋育種工作相對滯后，缺少高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的新品種[3]。雜交育種是培育魔芋新品種的有效途徑，但魔芋雌雄同株不同花造成的生殖隔離和魔芋種間花期相差較遠造成的時間隔離一直是制約魔芋雜交育種工作的瓶頸[4]。近年來，已基本完成通過溫濕度調(diào)控魔芋花期以克服時間隔離的研究。但天然授粉成功率低、花粉材料浪費嚴(yán)重，故采用人工輔助授粉顯得尤為必要。魔芋花粉包含本屬植物的各種基因類型，是種質(zhì)保存和交換的重要材料[5]?；ǚ勖劝l(fā)的情況直接決定了雜交育種工作的成敗，花粉萌發(fā)的情況通常受花粉本身活力、萌發(fā)條件等影響[6]。本試驗以花魔芋花粉為研究材料，研究不同培養(yǎng)環(huán)境條件對其花粉萌發(fā)的影響，以期為魔芋雜交育種工作中的人工輔助授粉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為安康地區(qū)重要的栽培農(nóng)家品種嵐皋花魔芋 (A.konjac)，定植于安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所魔芋種質(zhì)資源圃。2017年5月8日下午5時切取第2天要散粉植株的雄花序，放在硫酸紙上，第2天收集散出的成熟花粉。

1.2 花粉培養(yǎng)法

采用離體培養(yǎng)法，選用0.7%瓊脂固體培養(yǎng)基。溶化后取5 mL液態(tài)培養(yǎng)基加入直徑90 mm培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固?；ǚ塾眠m量無菌水稀釋并充分混勻，滴管滴取花粉懸浮液于培養(yǎng)皿中，并用涂布器涂抹均勻。蓋好培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中(28 ± 0.2) ℃下暗培養(yǎng)。

選用Olympus CX-22，10×10倍顯微鏡下觀察統(tǒng)計。以花粉管長度超過花粉粒直徑的一半以上作為花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，用明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)進行花粉管長度測量。每個處理每次觀察隨機取6個視野計數(shù)(注：每個視野花粉不少于30粒)，重復(fù)3次，計算平均萌發(fā)率。利用Excel和SPSS 19.0進行試驗數(shù)據(jù)分析。

花粉萌發(fā)率 /%=(萌發(fā)的花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))× 100

1.3 試驗處理

1.3.1 最適培養(yǎng)基篩選

以花魔芋花粉為供試材料，采用離體萌發(fā)法進行最佳培養(yǎng)基篩選試驗[7]。設(shè)定最適培養(yǎng)基組分[8](蔗糖、硼酸、Ca(NO3)2、MgSO4、KNO3)及各組分含量，利用SPSS軟件設(shè)計5因子4水平的正交實驗方案(表1)。以李勇軍報道的[9]魔芋花粉離體培養(yǎng)配方：蔗糖10%、硼酸200 mg·L-1、Ca(NO3)2300 mg·L-1、MgSO4200 mg·L-1、KNO3100 mg·L-1為對照。培養(yǎng)基pH值設(shè)定為6.5，在28 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)4 h后，檢測花粉的萌發(fā)率以及花粉管長度，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果確定最佳培養(yǎng)基組分，并利用相關(guān)矩陣分析不同培養(yǎng)基組分對花魔芋花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響。

1.3.2 最適培養(yǎng)溫度篩選

以花魔芋花粉為供試材料，基本培養(yǎng)基選用1.3.1中篩選出的最適培養(yǎng)基(表1編號5培養(yǎng)基)，培養(yǎng)基pH值設(shè)定為6.5，在此基礎(chǔ)上設(shè)置培養(yǎng)溫度(4、10、16、22、28、34、40 ℃)進行培養(yǎng)，4 h后取出培養(yǎng)皿分別檢測花粉萌發(fā)率及花粉管長度。

1.3.3 最適培養(yǎng)時間測定

以花魔芋花粉為供試材料，基本培養(yǎng)基選用1.3.1中篩選出的最適培養(yǎng)基(表1編號5培養(yǎng)基)，培養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)定為28 ℃，培養(yǎng)基pH值設(shè)定為6.5，在此基礎(chǔ)上設(shè)置培養(yǎng)時間(0.5、2.0、4.0、12.0、24.0、48.0 h)進行培養(yǎng)，在不同的培養(yǎng)時間取出培養(yǎng)皿分別統(tǒng)計當(dāng)前的花粉萌發(fā)率及花粉管長度。在統(tǒng)計過程中，隨著觀察時間的延長，已萌發(fā)的花魔芋花粉管逐漸出現(xiàn)破裂解離的現(xiàn)象，影響試驗記錄的延續(xù)性。故在本試驗中，前一時間段里已萌發(fā)或萌發(fā)且花粉管破裂解離的花粉細胞不計在當(dāng)前的花粉萌發(fā)數(shù)內(nèi)。

1.3.4 最適培養(yǎng)pH值測定

以花魔芋花粉為供試材料，基本培養(yǎng)基選用1.3.1中篩選出的最適培養(yǎng)基(表1編號5培養(yǎng)基)，培養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)定為28 ℃，在此基礎(chǔ)上設(shè)置培養(yǎng)pH值(4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)分別進行培養(yǎng)，4 h后取出培養(yǎng)皿分別檢測花粉萌發(fā)率及花粉管長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對花魔芋花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

結(jié)果表明：花魔芋花粉在16號培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，在1、5、6、9號和CK培養(yǎng)基上均能較好的萌發(fā)，萌發(fā)率達到19.00%以上(表1)。其中在5號培養(yǎng)基上花魔芋花粉萌發(fā)率最高為28.95%，CK次之，萌發(fā)率為26.24%。且5號和CK較其他幾種處理差異極顯著。從花粉管長度來看，在5號培養(yǎng)基上效果最佳，花粉管長度達到205.34 μm，與其他幾種處理差異極顯著。故5號培養(yǎng)基(組分為蔗糖10%、H3BO3100 mg·L-1、Ca(NO3)2200 mg·L-1、MgSO4300 mg·L-1、KNO3200 mg·L-1)最適宜于做花魔芋花粉的萌發(fā)和花粉管生長研究。

由表2相關(guān)矩陣分析可見，不同培養(yǎng)基組分對花魔芋花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響不同。對于花魔芋花粉萌發(fā)率而言，影響程度依次是硼酸濃度>蔗糖濃度>KNO3濃度>Ca(NO3)2濃度>MgSO4濃度。對于花魔芋花粉管長度而言，影響程度依次是硼酸濃度>KNO3濃度>Ca(NO3)2濃度>MgSO4濃度>蔗糖濃度。

表1 不同培養(yǎng)基對花魔芋花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Table 1 Effect of different culture medium on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac.

注：表中各字母表示不同處理間在0.01極顯著水平上差異顯著，花粉萌發(fā)率之間的差異性用大寫字母表示，花粉管長度之間的差異性用小寫字母表示。

Note： The differences in germination rate of pollen were expressed in capital letters and in length of pollen tube in lowercase letters.

表2 相關(guān)矩陣分析Table 2 Related Matrix analysis

2.2 溫度對花魔芋花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

由圖1可見，花魔芋花粉的萌發(fā)率隨著培養(yǎng)溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時花粉萌發(fā)率為27.50%，達到最大值。溫度超過34 ℃，萌發(fā)率又迅速下降。28 ℃時的萌發(fā)率較 22 ℃和34 ℃而言差異不顯著，但較其他4個處理差異極顯著。在4 ℃和40 ℃時，花魔芋花粉萌發(fā)均較低，說明該溫度分別接近花魔芋花粉萌發(fā)的極限低溫和極限高溫。就花粉管長度而言，培養(yǎng)溫度為28 ℃時達到最大值為251.78 μm，較其它溫度下的花粉管長度差異極顯著。溫度為4 ℃和40 ℃時，僅有零星花粉管生長，且平均長度分別為38.27 μm和 40.12 μm，僅為28 ℃時的15%左右。

試驗表明：培養(yǎng)溫度過高或過低均不利于花魔芋花粉的萌發(fā)及花粉管的伸長。花魔芋花粉僅在22～28 ℃范圍內(nèi)較好的萌發(fā)和生長，其中28 ℃是其離體培養(yǎng)的最適溫度。

圖1 不同溫度對花魔芋花粉活萌發(fā)率和花粉管長度的影響Fig.1 Effect of different culture temperature on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac 注：圖中各字母表示不同處理間在0.01極顯著水平上差異顯著，花粉萌發(fā)率之間的差異性用大寫字母表示，花粉管長度之間的差異性用小寫字母表示。下同。 Note: The differences in germination rate of pollen were expressed in capital letters and in length of pollen tube in lowercase letters.The same below.

2.3 培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

魔芋花粉接種后，在(28 ± 0.2) ℃條件下暗培養(yǎng)，定時測定當(dāng)前花粉的萌發(fā)率和花粉管長度。由圖2可見，隨著培養(yǎng)時間的延長花粉的即時萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。培養(yǎng)4 h時，花粉即時萌發(fā)率達到最大值為27.20%，較其它幾種處理差異極顯著。隨著觀察時間的延長，花粉即時萌發(fā)率顯著降低。表明4 h時，花魔芋花粉集中萌發(fā)，為花魔芋花粉萌發(fā)率最佳觀察時間。

圖2 不同培養(yǎng)時間對花魔芋花粉活萌發(fā)率和花粉管長度的影響Fig.2 Effect of different culture time on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac

花魔芋即時花粉管長度受不同培養(yǎng)時間影響，在培養(yǎng)0.5～4 h時間范圍內(nèi)，即時花粉管長度隨著培養(yǎng)時間的延長而增長。培養(yǎng)4 h時，即時花粉管長度達最大值，為263.36 μm。較其他時間段而言，差異極顯著。在培養(yǎng)4～24 h時間范圍內(nèi)，即時花粉管長度呈現(xiàn)急劇下降趨勢。在24～48 h內(nèi)，即時花粉管長度變化平緩?；谂囵B(yǎng)后即時花粉萌發(fā)率和即時花粉管長度的表現(xiàn)趨勢，故4 h為花魔芋花粉離體培養(yǎng)觀察統(tǒng)計的最適時間。

2.4 培養(yǎng)基pH值對花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

由圖3可見，花魔芋花粉萌發(fā)率隨著pH值的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在培養(yǎng)基pH值6.0和6.5時花粉萌發(fā)率分別為17.09%和17.24%，與其它幾種處理相比，達到了極顯著差異水平。pH值4.0～6.0時花粉管長度沒有明顯變化，pH值6.5時，花粉管長度明顯上升，且達到最大值，為114.45 μm，較其它幾種處理差異極顯著。當(dāng)pH值高于6.5之后，花粉管長度隨著pH值的增大而降低。即花魔芋花粉萌發(fā)和花粉管伸長的最適pH值為6.5。

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于魔芋花粉保存及萌發(fā)的研究相對較少，張盛林等[10]、李勇軍等[9]研究表明真空干燥低溫保存能將魔芋花粉活力維持在一個來年可利用的范圍內(nèi)。張玉進[11]等研究表明魔芋花粉經(jīng)液氮超低溫 (-196 ℃)保存后，較新鮮花粉有更高的離體萌發(fā)率。目前，花粉生活力評價主要方法有染色法、離體萌發(fā)法及授粉法等[6,7,12]。對魔芋而言，前期的研究主要通過萌發(fā)法來檢測貯藏魔芋花粉活力[9,11,13]，花粉萌發(fā)法測定花粉生活力的確最為直觀、準(zhǔn)確，但需在25～28 ℃培養(yǎng)3～4 h甚至更長時間，所以李勇軍等[14]通過魔芋花粉生活力檢測方法的比較研究得出了TTC染色法測定更適用于魔芋花粉活力的快速檢測，目前該方法在魔芋花粉活力的檢測中應(yīng)用極廣。

圖3 不同pH值對花魔芋花粉活萌發(fā)率和花粉管長度的影響Fig.3 Effect of different pH values on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac

花粉內(nèi)壁以及營養(yǎng)細胞的質(zhì)膜在萌發(fā)孔處外突，形成花粉管的乳狀頂端的過程稱為花粉萌發(fā)[15]。有研究表明：硼是影響花粉萌發(fā)的重要因素之一[16,17]。離體培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中加入適量的硼和Ca2+有助于花粉的萌發(fā)[18,19]。這與本研究結(jié)果相一致。一般情況下，一定面積內(nèi)的人工培養(yǎng)基或柱頭上的花粉粒越多，其萌發(fā)率就越高，花粉管的生長也越好，這一現(xiàn)象被稱之為集體效應(yīng)。有學(xué)者推測花粉的集體效應(yīng)可能與花粉本身帶有激素和營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用不同。

李勇軍等[20]研究了不同培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)溫度對魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響。其研究結(jié)果顯示，魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長的適宜蔗糖濃度為10%～ 15%，適宜培養(yǎng)溫度為26～28 ℃，適宜硼酸濃度為150～200 mg·L-1，適宜硝酸鈣濃度為200～300 mg·L-1。這與本研究篩選出的最適培養(yǎng)基配方：蔗糖10%、硼酸H3BO3100 mg·L-1、Ca(NO3)2200 mg·L-1、MgSO4300 mg·L-1、KNO3200 mg·L-1略有差異。本研究對離體培養(yǎng)基配方中的每一個組分及其用量均進行了細致研究，從而篩選出最佳組合以應(yīng)用于實驗中。前期研究證實一定濃度的硼酸和硝酸鈣可促進魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長。硝酸鉀在一定濃度范圍內(nèi)對魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長影響不顯著[20]。本研究通過不同營養(yǎng)組分與花粉萌發(fā)率及花粉管長度的相關(guān)性分析得出對于花魔芋花粉萌發(fā)率而言，影響程度最大的是硼酸濃度，而后依次是蔗糖濃度、KNO3濃度、Ca(NO3)2濃度、MgSO4濃度。對于花魔芋花粉管長度而言，影響程度最大的依然是硼酸濃度，而后依次是KNO3濃度、Ca(NO3)2濃度、MgSO4濃度和蔗糖濃度。

在本試驗中，以最重要的魔芋栽培種花魔芋花粉為研究材料，具有很強的代表性。但是離體培養(yǎng)條件研究中，萌發(fā)率均不高。這一結(jié)果與李勇軍等[20]研究結(jié)果較為一致。推測花粉整體萌發(fā)率不高的原因在于：首先，新鮮采集的花粉本身的萌發(fā)率并不高，這可能與散粉時節(jié)的氣候條件有一定關(guān)系。再者，固體培養(yǎng)時如何將花粉均勻散布并保持恒定的培養(yǎng)基表面濕度，可能會影響花粉本身的萌發(fā)率。因此，培養(yǎng)方法的改進很有必要。本研究的花粉管長度與李勇軍等[20]研究結(jié)果存在一定差異，推測主要是因為不同地方種魔芋花粉本身差異較大。