一種嗜藍(lán)孢孔菌新種的分離鑒定與菌株初步篩選

南曉潔，郭尚*，周林*，王華，劉曉鋼，李艷婷，張紅剛

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

嗜藍(lán)孢孔菌屬(FomitiporiaMurrill)于1907年首次被Murrill報(bào)道[1]，隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes)，銹革孔菌目(Hymenochaetales)，銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)。在過去的一段時(shí)間里，有研究者將嗜藍(lán)孢孔菌屬歸入桑黃屬(Phellinus)，并認(rèn)為與桑黃屬的Phellinuspunctatus-robustus的復(fù)合體具有很大的關(guān)聯(lián)。該復(fù)合體的主要特征是具有球形到近球形、厚壁、嗜藍(lán)和似糊精狀的擔(dān)孢子，二系菌絲系統(tǒng)，多變的子實(shí)層剛毛和小隔胞[2]。而Fomitiporia通常具有兩種子實(shí)體形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)：Fomitiporiapunctata的復(fù)合體的種表現(xiàn)為具有倒置的擔(dān)子果，F(xiàn)omitiporiarobusta的復(fù)合體的種具有傘形菌蓋的擔(dān)子果。近年來(lái)，根據(jù)分子生物學(xué)的研究表明，Phellinuspunctatus-robustus復(fù)合體的種與銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)形成了明顯的、單系的分支[3]。

我國(guó)地域遼闊，森林生態(tài)類型多樣，為木生真菌的生長(zhǎng)提供了豐富基質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)100余種木生真菌，大部分發(fā)現(xiàn)于廣西、云南、東北等地。在過去的20年間，隨著形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，對(duì)嗜藍(lán)孢孔菌屬的研究也有了很大的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了許多嗜藍(lán)孢孔菌屬的新的分類單元[4～11]。

本文的研究對(duì)象是本課題組在山西同朔地區(qū)沙棘樹上首次發(fā)現(xiàn)并采集到的一種木生真菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)研究分析，認(rèn)為該菌具有明顯的Fomitiporia屬的特征，并在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成一個(gè)獨(dú)立的亞分支，確定為Fomitiporia屬的一個(gè)新種，命名為FomitiporiayanbeiensisS. Guo&L. Zhou[12]。本研究通過對(duì)FomitiporiayanbeiensisS. Guo&L. Zhou適宜不同碳源的母種菌株株系及適宜不同主料產(chǎn)區(qū)的原種菌株株系進(jìn)行篩選，以期為該菌的人工馴化與開發(fā)利用提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料采集與分離純化、培養(yǎng)保存

本課題組在2015年10月于山西同朔地區(qū)的沙棘樹(HippophaerhamnoidesLinn.)上采集到一種嗜藍(lán)孢孔菌屬真菌，標(biāo)本編號(hào)SXSYJBB1510，保存于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。將采集的子實(shí)體進(jìn)行組織分離得到純菌株，保存于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，編號(hào)為SXSYJJZ No.1510，同時(shí)送中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保存，編號(hào)為CGMCC No.13380。

選取尚未木質(zhì)化、無(wú)任何破損、新鮮的子實(shí)體，用干凈刷子刷去表面的雜質(zhì)，用75%的酒精擦洗固體外表面5 次進(jìn)行消毒，然后置于無(wú)菌燒杯中備用。菌絲分離采用組織分離法[13]。將接入子實(shí)體組織塊的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中注入的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然)，用于菌種分離與保藏。接入子實(shí)體組織塊的培養(yǎng)皿移入消過毒的恒溫箱中，25 ℃倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中及時(shí)觀察記錄，如有感染雜菌及時(shí)檢出，避免感染其他培養(yǎng)皿。待長(zhǎng)出菌絲后，取生長(zhǎng)快、菌絲長(zhǎng)的菌絲塊，移入另一無(wú)菌平板培養(yǎng)皿表面培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，取生長(zhǎng)快、無(wú)雜菌污染的菌絲塊，移入10支斜面培養(yǎng)基表面，25 ℃培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿斜面且無(wú)雜菌，即為菌株1-10號(hào)，置4 ℃保存。

1.2 分離培養(yǎng)的菌株ITS DNA分子生物學(xué)鑒定

將分離的菌株通過ITS DNA分子生物學(xué)鑒定，并結(jié)合生態(tài)習(xí)性和腐朽類型等性狀進(jìn)行分析[12]。將培養(yǎng)的菌絲刮取50 mg，用CTAB方法提取總DNA，采用通用引物ITS5(GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G)和 ITS4(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用回收試劑盒(天根生化科技有限公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)得ITS序列上傳NCBI，進(jìn)行ITS DNA的Blast比對(duì)鑒定。

1.3 不同碳源篩選母種菌株試驗(yàn)

PDA 綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，維生素B1 10 mg，水1 000 mL，pH自然，用于母種1-10號(hào)菌種活化及繁育。

以PDA 綜合培養(yǎng)基中20 g葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，分別用等量的玉米粉、可溶性淀粉為碳源，代替供試培養(yǎng)基中的葡萄糖，pH 7.0～7.2，接入菌株1-10號(hào)，每處理設(shè)10次重復(fù)。無(wú)菌條件下，在各平板中央接種一直徑為5 mm的菌餅，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)、粗壯程度、疏密程度、菌落邊緣整齊度、菌落顏色等。直至菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，計(jì)算菌絲體日均生長(zhǎng)速度[菌絲生長(zhǎng)速度=菌落半徑增長(zhǎng)度(mm)/培養(yǎng)天數(shù)(d)]。

1.4 原種菌株篩選試驗(yàn)

采用小麥、玉米、小米三種培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株1-10號(hào)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。

原種培養(yǎng)基：小麥、玉米、小米為主料加2.5 kg，加入石膏粉25 g，碳酸鈣25 g，攪拌均勻，調(diào)至含水量60%～65%，裝袋，pH值自然。每袋裝料250 g左右，每個(gè)處理重復(fù) 20 次。接種后觀察菌株菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)菌株的ITS DNA分子生物學(xué)鑒定

將分離的菌株通過分子生物學(xué)研究方法，測(cè)得ITS DNA 789 bp序列片段，將此獲得的ITS片段，與FomitiporiayanbeiensisS. Guo&L. Zhou的在GenBank登陸ITS 序列(NCBI No. KT861405.1)進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果與FomitiporiayanbeiensisS. Guo&L. Zhou是同屬同種，證明本試驗(yàn)所分離使用的菌種確實(shí)準(zhǔn)確無(wú)誤，保證了試驗(yàn)用材料的真實(shí)性(圖1)。

2.2 適宜不同碳源的母種菌株株系的篩選

Fomitiporiayanbeiensis在供試的 3種碳源中均能生長(zhǎng)，但不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響明顯不同，從而篩選出適宜不同碳源的母種菌株株系，結(jié)果見表1。

表1 Fomitiporia yanbeiensis 不同株系在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)Table 1 Growth condition of Fomitiporia yanbeiensis in different carbon sources

注：“+++”表示菌絲粗壯、致密；“++”表示菌絲密、長(zhǎng)勢(shì)壯；“+”表示菌絲稀疏、纖弱

Note："+++" indicates that the mycelium is thickness; "++"indicates that the mycelium is dense and strong; "+" indicates that the mycelium is sparse and slim.

圖1 分離菌株的ITS序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 ITS alignment results of isolated strain

表1給出了Fomitiporiayanbeiensis1-10號(hào)菌株在3種碳源培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)。其結(jié)果顯示，菌絲生長(zhǎng)速度的快慢依次是玉米粉、葡萄糖、可溶性淀粉，平均生長(zhǎng)速度分別為2.22 mm·d-1、2.12 mm·d-1和2.05 mm·d-1，其中以玉米粉為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的母種菌絲生長(zhǎng)速度最快。

以玉米粉為碳源培養(yǎng)的1-10號(hào)菌株中，1、2、4、5、8、10號(hào)的菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)良好，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)(均為+++)。菌絲生長(zhǎng)速度最快的是1號(hào)菌株，為2.27 mm·d-1，其次為2號(hào)(2.23 mm·d-1)、其余為2.20～2.22 mm·d-1。 6號(hào)和9號(hào)菌株，菌絲生長(zhǎng)速度分別為2.24 mm·d-1和2.23 mm·d-1，但是菌絲生長(zhǎng)勢(shì)較弱(均為+)，3號(hào)株系和7號(hào)株系，菌絲生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)中等(均為++)，但菌絲生長(zhǎng)速度較慢。綜合菌絲生長(zhǎng)速度以及菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)的特性考慮，1號(hào)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度最快且菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，是最適于在添加玉米粉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株。

以可溶性淀粉為碳源培養(yǎng)的1-10號(hào)菌株中，3、4、6、7號(hào)的菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)良好，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)(均為+++)。其中菌絲生長(zhǎng)速度最快的是6號(hào)菌株，為2.12 mm·d-1，其次為4號(hào)和7號(hào)，分別為2.09 mm·d-1和2.07 mm·d-1，3號(hào)菌絲生長(zhǎng)速度最慢為1.94 mm·d-1。1、2、5、8、10號(hào)株系的菌絲生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)中等(均為++)，菌絲生長(zhǎng)速度為2.05～2.10 mm·d-1。9號(hào)菌株的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最弱(為+)，菌絲生長(zhǎng)速度也較慢，僅為1.95 mm·d-1。綜合菌絲生長(zhǎng)速度以及菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)的特性考慮，6號(hào)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度最快且菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，是最適于在添加玉米粉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株。

以葡萄糖為碳源培養(yǎng)的1-10號(hào)菌株中，1、3、5、8號(hào)的菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)良好，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)(均為+++)。其中菌絲生長(zhǎng)速度最快的是5號(hào)菌株，為2.17 mm·d-1，其次為1號(hào)和3號(hào)，分別為2.15 mm·d-1和2.11 mm·d-1，8號(hào)菌絲生長(zhǎng)速度最慢為2.07 mm·d-1。7號(hào)和10號(hào)菌株，菌絲生長(zhǎng)速度分別為2.11 mm·d-1和2.13 mm·d-1，但是菌絲生長(zhǎng)勢(shì)較弱(均為+)，2、4、6和9號(hào)株系，菌絲生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)中等(均為++)，菌絲生長(zhǎng)速度為2.11～2.14 mm·d-1。綜合菌絲生長(zhǎng)速度以及菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)的特性考慮，5號(hào)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度最快且菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，是最適于在添加葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株。

由此篩選出適宜玉米粉培養(yǎng)的母種菌株為1號(hào)，適宜可溶性淀粉培養(yǎng)的為6號(hào)菌株，適宜葡萄糖培養(yǎng)的為5號(hào)菌株。

2.3 適宜不同主料產(chǎn)區(qū)的原種菌株株系的篩選

本試驗(yàn)采用小麥、玉米、小米三種培養(yǎng)基質(zhì)，對(duì)1-10號(hào)菌株接種后30 d和45 d進(jìn)行了菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)研究，其結(jié)果見表2。

表2 Fomitiporia yanbeiensis 原種菌絲在不同培養(yǎng)基質(zhì)下的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth condition of Fomitiporia yanbeiensis in the different media

原種菌絲培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥、玉米和小米均可作為主料用于培養(yǎng)Fomitiporiayanbeiensis原種。Fomitiporiayanbeiensis在3種培養(yǎng)基中接種后30 d，1-10號(hào)菌株的滿袋率及平均滿袋率由高到低依次是玉米培養(yǎng)基、小麥培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基，同接種后45 d時(shí)的排序一致，表明Fomitiporiayanbeiensis菌絲在玉米培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，小麥培養(yǎng)基次之，而在小米培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最慢。使用玉米培養(yǎng)基，在接種后30 d時(shí)平均滿袋率已為72.5%，45 d時(shí)則高達(dá)91.5%；小麥培養(yǎng)基，在接種后30天時(shí)為36.5%，45 d時(shí)為84.5%；而使用小米培養(yǎng)基，在接種后30 d時(shí)平均滿袋率雖然僅為7%，但在45 d時(shí)，其平均滿袋率也達(dá)64%。

使用玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)的1-10號(hào)菌株中，1號(hào)菌株接種后30 d和45 d時(shí)，滿袋率均為最高，分別為80%和95%；而2、8和10號(hào)菌株，雖在接種后30 d的滿袋率為70%～75%，但在接種后45 d時(shí)的滿袋率也達(dá)到95%。而使用小麥培養(yǎng)基培養(yǎng)的10個(gè)菌株中，6號(hào)菌株接種后30 d和45 d時(shí)，滿袋率均為最高，分別為45%和95%。使用小米培養(yǎng)基培養(yǎng)的10個(gè)菌株中，6號(hào)菌株接種后30 d和45 d時(shí)，滿袋率均為最高，分別為20%和80%。由此可見，適宜玉米培養(yǎng)的菌株為1號(hào)，適宜小麥和小米培養(yǎng)的均為6號(hào)菌株。終而篩選出相應(yīng)的適宜原種，可在我國(guó)主產(chǎn)小麥、玉米和小米等大宗糧食作物及雜糧作物的地區(qū)，用于原種生產(chǎn)。

3 討論與結(jié)論

嗜藍(lán)孢孔菌屬Fomitiporia真菌是一類非常重要的藥用真菌，隸屬于銹革孔菌科，目前報(bào)道包含有37個(gè)種[14]，我國(guó)報(bào)道的有13個(gè)種[5]。本文研究對(duì)象FomitiporiayanbeiensisS. Guo&L. Zhou經(jīng)形態(tài)學(xué)特性及分子系統(tǒng)發(fā)育研究，確定為Fomitiporia.屬的一個(gè)新種。Fomitiporiayanbeiensis標(biāo)本采集自山西省同朔地區(qū)，海拔1 352 m，北緯39°98′、東經(jīng)112°47′，該地區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，是山西地區(qū)針闊葉林和混交林地帶的生長(zhǎng)處[12]。

在Fomitiporiayanbeiensis的采集地，當(dāng)?shù)厝藗儗⑵渥鳛閭鹘y(tǒng)藥物，本品甘溫微苦，具有提高免疫力、抗感冒等功效。對(duì)Fomitiporiayanbeiensis營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值和急性毒性進(jìn)行分析，表明其蛋白質(zhì)含量豐富為16.10%、氨基酸組成合理為12.51%、粗多糖為2.14%、粗脂肪含量較低為1.02%，并含有三萜類化合物、多糖類、黃酮等多種對(duì)人體有益的功能性成分；通過小鼠急性毒性試驗(yàn)分析，確定該菌無(wú)急性毒性，具有很高的開發(fā)和利用價(jià)值[15]。

Fomitiporia.屬是一類藥用功能的大型真菌，具有很高的藥用價(jià)值[16]，但由于研究開發(fā)時(shí)間較短，人工馴化栽培還有許多困難，諸如菌絲生長(zhǎng)發(fā)育、菌絲轉(zhuǎn)化、子實(shí)體形成等還有很多技術(shù)環(huán)節(jié)沒有得到解決,其中很重要的一個(gè)如菌種繁育中的母種轉(zhuǎn)管、原種擴(kuò)繁等的菌種變異或菌種污染就是難以避免的關(guān)鍵技術(shù)[17，18]。在本試驗(yàn)中非常注重這一點(diǎn)，首先將分離得到的菌種進(jìn)行確認(rèn)，以避免在以后階段的菌絲培養(yǎng)、馴化出菇階段等造成不知原因的失敗。

在本試驗(yàn)中，將分離菌株測(cè)得的ITS序列與試驗(yàn)材料原種雁北嗜藍(lán)孢孔菌FomitiporiayanbeiensisS. Guo&L. Zhou的序列在GenBank中NCBI進(jìn)行了Blast比對(duì)，得到了100%的相似性結(jié)果，證明為同種。而與Fomitiporiasp. HC-2016b(NCBI No. KU364417.1)和Fomitiporiasp. HC-2016 a(NCBI No. KU364423.1)只有96%和95%的相似性，根據(jù)序列相似度在97%以下，已低于種間水平的允許差異標(biāo)準(zhǔn)[19，20]，表明為不同種。

不同種類的食用菌以及同種類食用菌的不同品種或菌株對(duì)于營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)環(huán)境是有不同要求的，其本身都有特定的生理特性[21，22]。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)omitiporiayanbeiensis在供試的玉米粉、葡萄糖、可溶性淀粉3種碳源中均能生長(zhǎng)，適合以玉米粉為碳源的為1號(hào)菌株，適合以可溶性淀粉為碳源的為6號(hào)菌株，5號(hào)菌株則適宜以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而篩選出適宜上述3種碳源培養(yǎng)的母種菌株。

小麥、玉米和小米均可作為主料生產(chǎn)用于篩選Fomitiporiayanbeiensis原種菌絲。使用玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)的1-10號(hào)菌株中，1號(hào)菌株滿袋率最高，原種菌絲生長(zhǎng)狀況最好，這與母種菌絲試驗(yàn)中結(jié)果一致，故1號(hào)菌株適合在以玉米為主料的原種生產(chǎn)中使用。而使用小麥和小米培養(yǎng)基，均為6號(hào)菌株滿袋率最高，原種菌絲生長(zhǎng)狀況最好。小麥和小米中均含有可溶性淀粉等，恰恰為原種菌絲生長(zhǎng)所需的碳源供給。該結(jié)果也與母種菌絲試驗(yàn)中結(jié)果一致，故1號(hào)菌株適合在以玉米為主料的原種生產(chǎn)中使用。

通過不同碳源篩選母種菌株和以三種主要大宗糧食作物及雜糧為主料對(duì)原種菌株的篩選，可為使用相關(guān)碳源或主料生產(chǎn)原種的菌種生產(chǎn)提供理論依據(jù)。