基于SEM分析的6種松屬樹(shù)種花粉特征及親緣關(guān)系研究

解慶，段君懌，劉志紅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801)

松屬(Pinus)植物是裸子植物中的最大類群，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，全球約有80余種。中國(guó)產(chǎn)22種10變種，分布廣泛。松屬植物的分類問(wèn)題向來(lái)廣受關(guān)注，前人嘗試用不同的方法為該屬樹(shù)種的分類提供可靠證據(jù)[1～5]。

油松(P.tabulaeformis)的分類地位明確，作為松屬代表性物種，常常作為相近樹(shù)種分類地位研究的參照。但因油松在我國(guó)分布很廣，形態(tài)變異較大，對(duì)于油松的種群和名稱的界定較混亂，為此，前人經(jīng)過(guò)了不斷的實(shí)地調(diào)查和整理修訂。胡先骕、樂(lè)天宇將在太行山果松嶺海拔2 500 m處的一種樹(shù)干叢生的油松鑒定為太行松(P.taihangshanensis)。中進(jìn)猛之進(jìn)和竹內(nèi)亮分別將河北霧靈山所產(chǎn)的側(cè)生縮短枝，且其上的葉密生的油松定名為P.tokunagai和P.tabulaeformisvar.tokunagai。劉慎諤、王戰(zhàn)的大果油松(P.tabulaeformisf.jeholensis)作為油松的變型，主要特征為：球果較大，可達(dá)7 cm；紫翅油松(P.tabulaeformisf.purpurea)與油松的主要表型性狀差異為種翅帶暗紫褐色。太行松、大果油松、紫翅油松、P.tokunagai和P.tabulaeformisvar.tokunagai等分類單元，或因環(huán)境所致，或因性狀不穩(wěn)定，均歸并為油松這一物種，經(jīng)修訂，油松種下分類僅保留了2個(gè)變種，即黑皮油松(P.tabulaeformisvar.mukdensis)和掃帚油松(P.tabulaeformisvar.umbraculifera)。

黑皮油松、掃帚油松分類地位的界定主要依據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)證據(jù)。花粉具有極強(qiáng)的保守性，結(jié)構(gòu)是由物種基因所決定，和植物的營(yíng)養(yǎng)器官相比更能反映植物的起源、演化、分類、物種及品種鑒定。因此，在前人研究的基礎(chǔ)上[6～13]，本文以親緣關(guān)系較近、分類地位明確的松屬植物油松及近緣種白皮松(P.bungeana)、樟子松(P.sylvestrisvar.mongholica)和華山松(P.armandi)為參照樹(shù)種，利用掃描電子顯微鏡對(duì)黑皮油松和掃帚油松等6個(gè)樹(shù)種自然干燥狀態(tài)下的花粉特征進(jìn)行觀察分析，為黑皮油松和掃帚油松的分類地位的界定提供孢粉學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白皮松、華山松和樟子松花粉于2017年5～6月采摘自山西省太谷縣，油松、黑皮油松和掃帚油松花粉由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供?；ǚ鄄烧獣r(shí)，選擇生長(zhǎng)發(fā)育健壯無(wú)病蟲(chóng)害的成年植株，當(dāng)各樹(shù)種進(jìn)入散粉期前、花粉自然成熟時(shí)進(jìn)行采摘。

每物種選取3株，隨機(jī)兼顧均勻的采集雄球花，并混合放置于先前準(zhǔn)備好的硫酸紙袋中，紙袋用夾子封好后，將紙袋放在溫暖、光照條件好的室內(nèi)環(huán)境中，待花粉充分散開(kāi)后，過(guò)100目篩，去除雜質(zhì)后，將花粉置于密封的試管，再放在干燥設(shè)備中，溫度保持在2～5 ℃，為后續(xù)試驗(yàn)備用。

1.2 方法

參照Nakagawa等[9]和Liu等[10]的方法，將干燥后的6個(gè)樹(shù)種供試花粉，分別均勻涂于粘有雙面膠帶的樣品臺(tái)上，于JEOL，JFC-1600離子濺射儀中噴金，然后置于JEOL，JSM-6490LV掃描電子顯微鏡下觀察記錄。分別選取各樹(shù)種近極面、遠(yuǎn)極面、赤道面、體表面紋飾、氣囊表面等進(jìn)行拍照，應(yīng)用Smile view軟件測(cè)量花粉的全長(zhǎng)、全寬、體長(zhǎng)、體寬、氣囊長(zhǎng)、氣囊寬，并據(jù)此計(jì)算全長(zhǎng)/全寬、體寬/全長(zhǎng)、氣囊長(zhǎng)/氣囊寬。每樹(shù)種花粉測(cè)量10粒。利用SPSS20.0軟件，將上述9項(xiàng)特征指標(biāo)進(jìn)行多重比較，并利用平方歐式距離作聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒的大小

由表1中可知，6松屬樹(shù)種花粉大小均值的變動(dòng)范圍為44.00～53.53 μm，樟子松花粉最小，華山松花粉最大，花粉大小排列順序?yàn)槿A山松>掃帚油松>黑皮油松>白皮松>油松>樟子松。在各樹(shù)種間，花粉粒體的變異程度較小；氣囊寬均小于體寬；氣囊長(zhǎng)與氣囊寬的比值均小于1。在氣囊大小的測(cè)定中，將氣囊長(zhǎng)界定為與全長(zhǎng)、體長(zhǎng)同一軸向上，即氣囊長(zhǎng)是氣囊在遠(yuǎn)極面觀長(zhǎng)軸方向的長(zhǎng)度，該處理方式與Nakagawa等[9]和Liu等[10]相同，因此氣囊長(zhǎng)小于氣囊寬。

2.2 花粉粒的外部形態(tài)

白皮松、樟子松、華山松、油松、黑皮油松和掃帚油松花粉的形態(tài)相似，都由體和2個(gè)發(fā)達(dá)而顯著的氣囊組成，屬于雙氣囊的“松型”花粉(圖1)。由近極面觀，6個(gè)樹(shù)種花粉輪廓光滑，呈圓形至橢圓形；由赤道面觀，氣囊和帽交界處較粗糙，易形成帽沿。由遠(yuǎn)極面觀，因供試花粉為自然干燥狀態(tài)，2氣囊收縮至緊貼在一起，萌發(fā)溝不可見(jiàn)；氣囊表面光滑，且具有穿孔，穿孔有時(shí)連接成犁溝狀(圖1-Ⅰ6)；樟子松氣囊表面穿孔最少(圖1-Ⅲ6)。

表1 6個(gè)松屬樹(shù)種的花粉大小統(tǒng)計(jì)Table 1 The statistics of pollen size for 6 pinus taxa

注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，均值上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note： Mean value±std. deviation. Mean values with different letters are significantly different from each other (P<0.05).

2.3 花粉粒的表面紋飾

雖然不同松屬植物間體的特征比較穩(wěn)定，但在近極面觀體的表面紋飾具有較明顯的差異。按照表面紋飾的不同，可以分為2類：龜裂狀紋飾和團(tuán)塊狀突起紋飾。龜裂狀紋飾，雕紋堆積起來(lái)形成波浪狀，表面沒(méi)有疣狀顆粒分布[11]；本研究的6個(gè)松屬樹(shù)種的花粉都屬于團(tuán)塊狀突起紋飾，通過(guò)表面疣狀顆粒分布的多少又可以將其分成2類：一類表面疣狀顆粒有少量分布，雕紋相互堆積形成微波狀，包括白皮松、油松、黑皮油松和掃帚油松；另一類表面疣狀顆粒分布較多，雕紋平鋪，包括華山松和樟子松。

2.4 聚類分析結(jié)果

6個(gè)樹(shù)種間平方歐式距離的變幅從10.245到662.637(表2)。黑皮油松、掃帚油松與油松之間的平方歐式距離分別為24.267和11.652。白皮松、華山松、樟子松與油松之間的平方歐式距離分別為24.010、169.429、203.307，平均為132.249；表明黑皮油松與油松、掃帚油松與油松之間的遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于油松與各近緣種之間的遺傳距離。黑皮油松、掃帚油松作為油松的種下分類單元是合理的。

由聚類分析樹(shù)狀圖可知(圖2)，油松與黑皮油松、掃帚油松首先聚為一類，再分別與油松的近緣物種白皮松、樟子松和華山松相聚。表明油松與黑皮油松、掃帚油松親緣關(guān)系最近，這3個(gè)樹(shù)種與白皮松、樟子松親緣關(guān)系較近，與華山松親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。聚類結(jié)果亦支持將黑皮油松、掃帚油松作為油松的種下分類這一觀點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

在經(jīng)典植物分類學(xué)上，油松、白皮松、華山松為獨(dú)立物種，分類地位明確；樟子松屬于歐洲赤松的變型；黑皮油松、掃帚油松均屬于油松的變種。物種的種下分類一般認(rèn)為有變種、變型和亞種。變種與原變種之間無(wú)任何隔離，變異比較穩(wěn)定；變型與原變種之間也有形態(tài)變異，但未形成一定的分布區(qū)，表現(xiàn)為零星分布的單株；亞種的分布范圍比變種大得多，形態(tài)上與原變種有一定區(qū)別，在分布上、生態(tài)上或季節(jié)上有所隔離[14～16]。

本文通過(guò)對(duì)花粉的大小及表面紋飾的觀察分析，黑皮油松、掃帚油松與油松的親緣關(guān)系極為相近，將黑皮油松、掃帚油松界定為油松的種下分類單元。

油松和黑皮油松的生活習(xí)性相近，都是喜光植物且能耐干旱瘠??；在形態(tài)方面，也極為相似，生長(zhǎng)最高高度均達(dá)25 m，胸徑也都能達(dá)到1 m以上；分布區(qū)無(wú)隔離。掃帚油松與油松的主要區(qū)別表現(xiàn)莖干基部多分枝，但掃帚油松并沒(méi)有形成一定的分布區(qū)，呈單株零星分布。因此認(rèn)定黑皮油松為油松的變種，掃帚油松為油松的變型，掃帚油松的拉丁名建議為P.tabulaeformisf.umbraculifera。

油松與白皮松、樟子松、華山松同為松屬植物。松屬包括兩個(gè)亞屬：?jiǎn)尉S管束松亞屬和雙維管束松亞屬。白皮松屬于單維管束松亞屬；油松、樟子松和華山松屬于雙維管束松亞屬，油松和樟子松的針葉為2針一束，華山松的針葉為5針一束，油松與樟子松的親緣關(guān)系比油松與華山松的親緣關(guān)系近。

圖1 6種松屬樹(shù)種花粉形態(tài)的掃描電鏡觀察Fig.1 SEM pictures of pollens of 6 Pinus species 注：(I1-I6為白皮松，II1-II6為華山松，Ⅲ1-Ⅲ6為樟子松，IV1-IV6為油松，V1-V6為黑皮油松，VI1-VI6為掃帚油松，I1-VI1為遠(yuǎn)極面觀，I2-VI2為近極面觀，I3-VI3為赤道面觀，I4-VI4為近極面體的表面紋飾×5000，I5-VI5為近極面體的表面紋飾×10000，I6-VI6為氣囊表面特征×5000)。 Note:(I1-I6 P. bungeana,Ⅱ1-II6 P. armandi, Ⅲ1-Ⅲ6 P. sylvestris var. mongholica, IV1-IV6 P. tabulaeformis, V1-V6 P. tabulaeformis var. mukdensis, VI1-VI6 P. tabulaeformis var. umbraculifera, I1-VI1 Distal view, I2-VI2 Proximal view, I3-VI3 Equatorial view, I4-VI4 Corpus exine ornamentation×5000, I5-VI5 Corpus exine ornamentation×10000, I6-VI6 Saccus surface×5000).

樹(shù)種Taxa平方歐式距離Squared Euclidean distance白皮松P. bungeana華山松P. armandi樟子松P. sylvestris var.mongholica油松P. tabulaeformis黑皮油松P. tabulaeformis var. mukdensis掃帚油松P. tabulaeformis var. umbraculifera白皮松0.000156.483176.48224.01032.91923.216華山松156.4830.000662.637169.429278.590198.016樟子松176.482662.6370.000203.307105.530171.142油松24.010169.429203.3070.00024.26711.651黑皮油松32.919278.590105.53024.2670.00010.245掃帚油松23.216198.016171.14211.65210.2450.000

圖2 6種松屬植物的聚類分析Fig.2 Dendrogram of 6 Pinus taxa based on pollen characteristics 注：(BPS為白皮松，HSS為華山松，ZZS為樟子松，YS為油松，HPYS為黑皮油松，SZYS為掃帚油松)。 Note:(BPS, P. bungeana; HSS, P. armandi; ZZS, P. sylvestris var. mongholica; YS, P. tabulaeformis; HPYS, P. tabulaeformis var. mukdensis; SZYS, P. tabulaeformis var. umbraculifera).

按該分類法，油松與樟子松的親緣關(guān)系應(yīng)該比油松與白皮松近，但在本試驗(yàn)聚類圖(圖2)中所示，油松與白皮松的親緣關(guān)系卻比油松與樟子松的親緣關(guān)系近，原因可能是：?jiǎn)?、雙維管束松亞屬的劃分主要以針葉中維管束的數(shù)量為依據(jù)，隸屬解剖學(xué)特征。目前，植物分類常用的方法包括形態(tài)學(xué)分類法、解剖學(xué)分類法、細(xì)胞學(xué)分類法、孢粉學(xué)分類法、化學(xué)分類法和DNA分子標(biāo)記分類法，每一種方法都有不可替代的優(yōu)越性和不可避免的局限性。植物的分類須結(jié)合多種方法、綜合分析，才能更準(zhǔn)確地反映植物間的親緣關(guān)系和分類地位。從本文提供的孢粉學(xué)證據(jù)來(lái)看，相比樟子松，白皮松的花粉性狀特征與油松更加接近，這與謝樹(shù)蓮和凌元潔[13]的結(jié)果一致。油松、白皮松與樟子松之間的親緣關(guān)系有待進(jìn)一步研究。