溫腎固疏方干預(yù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松藥理研究

沈蘊(yùn)茹 郭海英

南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(post menopausal osteoporosis，PMOP)是一種受多種因素影響的代謝性疾病，婦女絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素降低，骨質(zhì)疏松癥常與脂代謝紊亂導(dǎo)致的心血管疾病伴隨發(fā)生。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響中老年婦女的日常生活甚至生命安全。近年來(lái)多項(xiàng)新研究闡明[1]，載脂蛋白E(epolipoprotein E，ApoE)不僅作為重要角色參與脂代謝，也同時(shí)會(huì)影響骨代謝，雌激素水平也被證實(shí)對(duì)ApoE有影響[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者多將絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松與脂代謝異常的著重點(diǎn)放于ApoE，集中研究ApoE對(duì)骨代謝與脂代謝的調(diào)節(jié)作用。溫腎固疏方具有溫陽(yáng)補(bǔ)骨、補(bǔ)腎健脾的功效，本研究通過(guò)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察溫腎固疏方對(duì)大鼠的以ApoE為連接點(diǎn)的骨質(zhì)量、強(qiáng)度以及脂代謝指標(biāo)的改變，尋找PMOP新的發(fā)病機(jī)制，并從此得到更加長(zhǎng)期有效，易于推廣普及的PMOP防治手段。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康9月齡未孕SPF級(jí)SD大鼠40只，雌性，體重(250±30)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SYXK(蘇)2014-0001-201508662。

1.2 儀器、藥物及試劑

溫腎固疏方各藥物組成由南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂藥房提供，方藥組成: 熟地20 g、淫羊藿20 g、黨參10 g、丹參10 g、枸杞10 g、骨碎補(bǔ)10 g、補(bǔ)骨脂5 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，兩次煎液過(guò)濾合并濃縮。戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，180 A)。10%水合氯醛溶液(中國(guó)人民解放軍第一醫(yī)院，20130312)。青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，B140808)。Elisa試劑盒購(gòu)自于南京森貝伽生物，大鼠OT/BGP試劑盒(20161212)，大鼠ApoE試劑盒(20161212)，大鼠Lip試劑(20161212)，大鼠sRANKL試劑盒(20161212)，大鼠BMPs試劑盒(20161212)，大鼠OPG試劑盒(20161212)。數(shù)字化雙能X線骨密度儀(MEDIX-90，法國(guó)MEDILINK公司)。CHD-1001 電子式雙柱萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)CHD-1001(東莞誠(chéng)鼎)。全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝TBA-120FR)。

2 研究方法

2.1 去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型的建立

采用雙側(cè)性腺(卵巢)摘除法[3]制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(22±2)℃、濕度控制于50%，恒溫、恒濕、清潔、通風(fēng)環(huán)境，自由飲食、飲水，飼養(yǎng)1 w后根據(jù)體重將SD大鼠隨機(jī)分為兩組:假手術(shù)組(Sham，n=6)、模型組(n=34)。模型組首先腹腔注射35 mg/kg的10%水合氯醛溶液麻醉，然后背部切口行去勢(shì)手術(shù)，剪除雙側(cè)卵巢，分層縫合。Sham組大鼠背部切口手術(shù)后，僅切除卵巢旁約1 g重的脂肪，不切除卵巢，最后每只大鼠經(jīng)后肢肌肉注射80000 U青霉素，連續(xù)7 d觀察。

2.2 分組及干預(yù)

造模過(guò)程中無(wú)因感染等原因而不適合繼續(xù)干預(yù)的大鼠。將摘除雙側(cè)卵巢的模型組大鼠(n=34)隨機(jī)分組，分為:模型組(OVX，n=6)，溫腎固疏方高劑量組(n=6)、中劑量組(n=6)、低劑量組(n=6)及雌激素組(n=6)，剩余4只放血處死。大鼠于上述飼養(yǎng)環(huán)境中自由攝食、飲水，每周稱(chēng)量體重一次。各組大鼠均于手術(shù)后3 w切口愈合后開(kāi)始分組治療干預(yù)。用臨床擬用計(jì)量法(ACD法)擬定大鼠同類(lèi)藥等效劑量，按成人6.30倍計(jì)算，給藥容積0.5 mL/100 g。溫腎固疏方治療組先計(jì)算出中劑量組計(jì)量，高劑量組為中劑量組2倍，低劑量組為中劑量組1/2。高劑量組：溫腎固疏方，21.21 g生藥/(kg·d)；中劑量組：溫腎固疏方，10.605 g生藥/(kg·d)；低劑量組：溫腎固疏方，5.3 025 g生藥/(kg·d)。雌激素組：戊酸雌二醇，10μg/(kg·d)。模型組：給予生理鹽水0.5 mL/100 g灌胃；假手術(shù)組給予生理鹽水0.5 mL/100 g灌胃。各組灌胃持續(xù)8 w。

2.3 標(biāo)本釆集及測(cè)定

大鼠末次施治后，禁食24 h，次日取材。處死前稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，用10%水合氯醛溶液(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，右心室抽血處死。血液收集后，4 ℃靜置3 h，3 000 r/min, 離心10 min，分離血清。酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定OT/BGP、sRANKL、OPG、BMPs、ApoE、Lip。全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、TG、TC，計(jì)算AI(AI=LDL-C/HDL-C)。骨質(zhì)量測(cè)定:取大鼠右側(cè)股骨、腰椎全段，放在有機(jī)玻璃盒支架上固定，以MEDIX-90骨密度測(cè)定儀掃描測(cè)定離體大鼠骨密度(bone mineral density,BMD)、骨礦含量(bone mineral content，BMC)。骨強(qiáng)度測(cè)定：取大鼠左側(cè)股骨，固定于電子式雙柱萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)上，測(cè)定股骨弾性模型、最大承載力、剛性、最大應(yīng)力。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠骨密度(BMD)、骨礦含量(BMC)變化

模型組與假手術(shù)組對(duì)比，模型組大鼠股骨、腰椎BMD、BMC明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，雌激素組、高、中、低計(jì)量組大鼠股骨、腰椎BMD、BMC皆有增高，其中股骨BMD、BMC的雌激素組、低、高劑量組增高明顯(P<0.05)。腰椎BMD、BMC雌激素組增高明顯(P<0.05)，BMC高劑量組增高明顯(P<0.05)，雌激素組與溫腎固疏方各劑量組的股骨、腰椎BMD、BMC皆高于模型組。見(jiàn)表1。

表1 溫腎固疏方對(duì)不同組別去勢(shì)大鼠股骨骨密度的影響Table 1 Effects of WenShenGuShu formula on BMD and BMC of rat with osteoporosis

注：與假手術(shù)組相比，▲P<0.05。與模型組相比，*P<0.05，△P<0.01。

3.2 大鼠股骨生物力學(xué)的變化

模型組與假手術(shù)組相比，模型組彈性模量、最大承載力、剛性、最大應(yīng)力皆顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，雌激素組、低、中、高劑量彈性模量、最大承載力、剛性、最大應(yīng)力皆高于模型組，其中，雌激素組、中劑量組弾性模型顯著增高(P<0.05)，雌激素組、高劑量組最大承載力顯著增高(P<0.05)，低劑量組與高劑量組剛性顯著增高(P<0.05)，雌激素組、低劑量組與高劑量組最大應(yīng)力顯著增高(P<0.05)，高劑量組最為明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3.3 大鼠血清骨代謝的變化

模型組與假手術(shù)相比，模型組血清骨谷胺蛋白/骨鈣素(OT/BGP)、OPG、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)下降，sRANKL上升。治療組與模型組相比，OT/BGP皆有上升，其中雌激素、中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高、低劑量組上升明顯(P<0.01)；sRANKL皆下降，其中高、低劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OPG各組均上升，其中雌激素組、低劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BMPs各組均上升，雌激素組，高、低計(jì)量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。溫腎固疏方高、低劑量灌胃對(duì)大鼠骨代謝作用明顯。見(jiàn)表3。

表2 大鼠股骨生物動(dòng)力學(xué)變化Table 2 Effects of WenShenGuShu formula on biomechanics of femur in rats with osteoporosis

注：與假手術(shù)組相比，▲P<0.05。與模型組相比，*P<0.05，△P<0.01。

表3 溫腎固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠骨代謝的影響Table 3 Effects of WenShenGuShu formula on bone metabolism of rats with osteoporosis

注：與假手術(shù)組相比，▲P<0.05。與模型組相比，*P<0.05，△P<0.01。

3.4 各組大鼠血清脂代謝的變化

模型組與假手術(shù)組對(duì)比，模型組Lipids、ApoE、LDL-C、TC均上升，HDL-C、TG均下降，Lipids、ApoE、LDL-C變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，動(dòng)脈硬化指數(shù)AI上升(P<0.05)。與模型組對(duì)比，雌激素組、低、中、高劑量組血清Lipids下降，低、中、高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低、高劑量組下降效果明顯(P<0.01)，雌激素組、低、高劑量組ApoE下降，低劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)。低、高劑量組LDL-C下降明顯(P<0.05)。低劑量組TG下降明顯(P<0.05)。雌激素組、低、中、高劑量組AI均有下降，低、高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且溫腎固疏方低、高劑量組AI低于雌激素組。見(jiàn)表4。

表4 溫腎固疏方對(duì)去勢(shì)大鼠脂代謝以及ApoE的影響

注：與假手術(shù)組相比，▲P<0.05。與模型組相比，*P<0.05，△P<0.01。

4 討論

前期研究表明[4]，骨質(zhì)疏松大鼠模型構(gòu)建后大鼠雌激素水平迅速下降，光鏡下觀察模型組大鼠病理切片，可見(jiàn)骨松質(zhì)骨小梁纖細(xì)明顯，數(shù)量減少，部分骨小梁斷裂呈典型骨質(zhì)疏松模型，提示該實(shí)驗(yàn)造模成功。本課題研究進(jìn)一步探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的新發(fā)病機(jī)制以及治療方案，參照絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨折的多發(fā)部位，測(cè)定大鼠股骨、腰椎的BMD、BMC，溫腎固疏方高、中、低劑量組與模型組比較，低、高劑量組大鼠股骨BMD、BMC上升明顯(P<0.05)，高劑量組大鼠腰椎BMC上升明顯(P<0.05)。測(cè)定股骨弾性模型、最大承載力、剛性、最大應(yīng)力，中劑量組弾性模型顯著增高(P<0.05)，高劑量組最大承載力顯著增高(P<0.05)，低劑量組與高劑量組剛性顯著增高(P<0.05)，低劑量組與高劑量組最大應(yīng)力顯著增高(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明經(jīng)溫腎固疏方治療后，去勢(shì)大鼠的骨質(zhì)量與骨強(qiáng)度皆有提升，有防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞與骨細(xì)胞兩者由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，基于雙向分化原理，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞會(huì)向脂肪細(xì)胞與骨細(xì)胞兩個(gè)方向分化?，F(xiàn)階段研究證明[5]，ApoE與Wnt信號(hào)通路的LRP受體結(jié)合，并能抑制PPARγ的活化，ApoE能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt通路與PPARγ從而影響β-catennin的表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化。OPG與sRANKL聯(lián)合說(shuō)明Wnt信號(hào)通路的改變，sRANKL表達(dá)增高說(shuō)明骨量流失。ApoE通過(guò)運(yùn)輸脂溶性維生素K參與骨細(xì)胞的生成，維生素K大部分由飲食供給，去勢(shì)大鼠正常飲食，說(shuō)明維生素K的結(jié)合受到影響，維生素K作為特別的脂溶性維生素只能與受體結(jié)合力較強(qiáng)的ApoE相結(jié)合運(yùn)輸[6-8]，維生素K能將骨鈣素中殘留的3谷氨酸羧化，該修飾過(guò)程對(duì)于維持γ-骨鈣素的完整性是必不可少的，骨鈣素水平下降會(huì)導(dǎo)致骨密度下降與骨脆性增加，OT/BGP下降說(shuō)明去勢(shì)大鼠骨生成收到影響[9]。BMPs(骨形成蛋白)促進(jìn)骨代謝作用與Smad 蛋白相偶聯(lián)，影響骨重建與骨吸收，參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的雙向分化，抑制內(nèi)源性BMP-4可以抑制PPARγ的表達(dá)，在前脂細(xì)胞分化中維持其狀態(tài)。本研究結(jié)果提示溫腎固疏方治療后模型大鼠各項(xiàng)骨代謝指標(biāo)與上述理論相吻合，低、高劑量組血清OT/BGP上升(P<0.05)；低、高劑量組sRANKL下降(P<0.05)；低劑量組血清OPG上升(P<0.05)；低、高劑量組BMPs上升(P<0.05)；高、中、低劑量組血清Lip下降(P<0.05)，低劑量組ApoE下降(P<0.05)；低、高劑量組LDL-C下降；低劑量組TG下降(P<0.05)。低、高劑量組AI下降(P<0.05)，且AI低于雌激素治療組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示溫腎固疏方通過(guò)調(diào)控ApoE，改善Wnt/PPAYγ的拮抗作用從而誘導(dǎo)β-catennin的表達(dá)，促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成，防止脂細(xì)胞形成，改善脂代謝異常，并促進(jìn)骨吸收，防止骨變異流失，進(jìn)而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松情況。

在中醫(yī)理論中，“腎主骨”，腎與骨的關(guān)系密切，《內(nèi)經(jīng)》指出婦女在絕經(jīng)前后，即“天癸衰”后會(huì)出現(xiàn)毛發(fā)枯黃，牙齒松動(dòng)，骨質(zhì)脆弱等表現(xiàn)。補(bǔ)腎一直以來(lái)作為中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松的主要方向。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究認(rèn)為，ApoE在中醫(yī)理論中與痰證關(guān)系緊密，《仁齋直指方》中提出“肥人氣虛生痰，故多痰濕”，說(shuō)明早于幾百年前就有臨床經(jīng)驗(yàn)研究指出脂代謝異常與痰濕體質(zhì)、證候互相作用。痰濕證候會(huì)導(dǎo)致脂代謝異常，脂代謝異常也會(huì)反作用于痰濕證候，使痰淤體內(nèi)，濕氣不排，進(jìn)而導(dǎo)致濕濁在體內(nèi)堆積，脾胃功能失調(diào)。脾胃與腎在藏象關(guān)系中聯(lián)系緊密，先天后天精微互相充養(yǎng)，脾胃功能失調(diào)，則后天之精運(yùn)化失調(diào)，后天之精不能充養(yǎng)先天之精，故導(dǎo)致腎氣不充，腎臟功能失司，腎精與水谷精微不能充養(yǎng)骨骼，便會(huì)進(jìn)一步引發(fā)骨枯、骨萎，也就是現(xiàn)代的骨質(zhì)疏松癥。ApoE在脂代謝與骨代謝調(diào)節(jié)中起到至關(guān)重要的作用，中醫(yī)理論中也與痰濕證候相關(guān)[10-12]，影響腎精充養(yǎng)骨的作用。大量臨床報(bào)告顯示絕經(jīng)前后婦女常同時(shí)伴有骨質(zhì)疏松和脂代謝異常導(dǎo)致的心血管系統(tǒng)疾病、阿爾茨海默病等，單一的他汀類(lèi)藥物或雌激素替代療法都未能取得更好的療效，長(zhǎng)期服用雌激素可能導(dǎo)致靜脈血栓和心血管疾病[13-15]，長(zhǎng)期服用雌激素的女性患有此類(lèi)疾病的可能性要較一般女性高出2倍左右[6]，并且會(huì)導(dǎo)致體重增加與明顯的情緒變化[16]，故持續(xù)使用雌激素替代療法并非相對(duì)完善的治療PMOP手段。溫腎固疏方由熟地20 g、淫羊藿20 g、黨參10 g、丹參10 g、枸杞10 g、骨碎補(bǔ)10 g、補(bǔ)骨脂5 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g按比例配伍制成。根據(jù)現(xiàn)代中藥研究，骨碎補(bǔ)[17]、熟地[18]、淫羊藿[19]皆有通過(guò)調(diào)節(jié)ApoE對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的雙向誘導(dǎo)分化作用，淫羊藿同時(shí)具有保護(hù)心血管的功能[20]。溫腎固疏方以溫腎健脾為治療原則，具有能夠長(zhǎng)期服用、副作用小、能在一副湯藥中通過(guò)草藥配伍整體治療的優(yōu)越點(diǎn)，并且具有中醫(yī)的整體治療觀念，能夠整體調(diào)節(jié)絕經(jīng)后婦女的激素代謝。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)量、骨強(qiáng)度、骨代謝以及脂代謝指標(biāo)的研究，證實(shí)溫腎固疏方通過(guò)調(diào)控ApoE從而改善骨代謝，防止骨流失，并能有效改善脂代謝，通過(guò)溫腎健脾法達(dá)到補(bǔ)骨的效果。但由于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種機(jī)制復(fù)雜的綜合代謝性疾病，其機(jī)制尚不明確，且實(shí)驗(yàn)依舊有改進(jìn)空間，如大鼠與人類(lèi)在生物形態(tài)學(xué)的不同導(dǎo)致部分結(jié)論不顯著、樣本量偏少、大鼠個(gè)體差異性等，對(duì)ApoE調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制依舊需要進(jìn)一步探討，希望能從中尋找新的防治思路。