麝香對(duì)骨缺損模型大鼠HMGB1和BMP2表達(dá)的影響

李寧 謝興文 宋敏 李建國(guó) 白壁輝 柴利軍 周文杰*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

道路交通傷及我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，致使骨折的發(fā)生率大幅度提高[1-3]。如何提高骨折后骨缺損的治愈率及愈合時(shí)間是骨科研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。已有研究表明，麝香不僅能夠阻斷IL-1β對(duì)體外終板軟骨細(xì)胞的破壞[4]，而且能夠增加骨密度，對(duì)骨壞死有治療作用[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，麝香可促進(jìn)顱骨骨缺損模型大鼠骨組織中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1、單核細(xì)胞趨化蛋白 1和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)。本項(xiàng)研究采用蛋白印跡技術(shù)擬檢測(cè)高遷移率族蛋白1(highmobilitygroupbox-1protein，HMGB1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP2)的表達(dá)，以期探討麝香促進(jìn)骨缺損愈合的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康6周齡SPF級(jí)SD大鼠300只，雌雄各半，體重(200±20)g，均購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食水。動(dòng)物設(shè)施使用證明No：00000230，動(dòng)物合格證號(hào)：62001000000201。

1.1.2藥物和試劑：麝香(蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，批號(hào):20151001)。氯胺酮注射液(西安力邦制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20054749)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20151231)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號(hào)：20160118)，北京索萊寶有限公司；抗HMGB1兔多克隆抗體、抗BMP2兔多克隆抗體，生工生物工程股份有限公司；GAPDH(批號(hào)：ZS-257780)、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記(批號(hào)：122107)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL顯色試劑(批號(hào)：1515601)，美國(guó) Millipore公司。

1.1.3設(shè)備：90顱骨鉆(STRONG公司)；DNM-9602酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司； PowerPoc Basic凝膠電泳儀、ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析儀，美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1顱骨骨缺損模型的制備：適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按照0.1 g/kg的劑量腹腔注射氯胺酮，麻醉顯效后，俯臥位固定大鼠頭部及四肢，頭部術(shù)區(qū)褪毛、碘伏消毒，取1～1.5 cm的縱行切口，分離骨膜、暴露顱骨，利用顱骨鉆在頂骨造成直徑約6 mm的圓形骨缺損，鹽水沖洗，去除殘存骨屑，逐層縫合后用碘伏消毒傷口。

1.2.2分組與給藥：造模完成后將大鼠按體重采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和給藥組，每組150只，再將這兩個(gè)組按照第7、14 和28 天分為3個(gè)小組，每組50只。給藥組按42 mg/kg灌服麝香，對(duì)照組灌服等體積的生理鹽水，均每日灌胃1次。

1.2.3標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)：分別在第7、14 和28 天時(shí)進(jìn)行顱骨骨缺損處取材。組織蛋白的提取嚴(yán)格按照BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明操作，蛋白上樣總量每個(gè)泳道為40 μg。SDS-PAGE凝膠制備嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，120 V電泳至溴酚藍(lán)移到凝膠底部，冰水浴200 mA轉(zhuǎn)膜60 min，5 %脫脂奶粉封閉90 min，分別加入BMP2一抗(稀釋度為1∶500)、HMGB1一抗(稀釋度為1∶2000)和GAPDH一抗(稀釋度為1∶2000)，冰箱4 ℃過(guò)夜。第二天TBST洗膜3次，每次10 min，山羊抗兔辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育90 min(稀釋度為1∶4000)，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光液顯影后凝膠成像分析儀采集圖像信號(hào)，Image J軟件分析各組條帶，將各組灰度值與內(nèi)參比較即得HMGB1和BMP2的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

給藥組HMGB1、BMP2在第7 天的表達(dá)均達(dá)到峰值(P<0.05)，第14 天時(shí)降低，第28 天時(shí)表達(dá)最低；與對(duì)照組比較，第7 天 HMGB1、BMP2表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥組第7 和14 天 HMGB1的表達(dá)明顯高于本組第28 天(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

圖1 HMGB1和BMP2在顱骨骨缺損模型大鼠組織中表達(dá)的結(jié)果Fig.1 Expression of HMGB1 and BMP2 in rat models of calvarial defect注：A、B、C為對(duì)照組，D、E、F為給藥組

3 討論

在臨床上由創(chuàng)傷、感染、畸形矯正等因素造成的骨缺損最為常見(jiàn)。目前，治療骨缺損的方法包括骨移植、Masquelet技術(shù)、基因治療等，但這些方法都有不同的缺點(diǎn)和局限性[6-8]。近些年，研究較多的組織工程技術(shù)為骨缺損的治療提供了新思路，而種子細(xì)胞、激活因子和支架材料等是其研究的主要方面[9]。

HMGB1是存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，因其在聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)中遷移速度快而得名[10]。近年來(lái)，HMGB1在炎癥過(guò)程中作為晚期炎性因子出現(xiàn)而備受關(guān)注，由損傷和壞死的細(xì)胞釋放，此外，內(nèi)毒素及多種炎性因子均可誘導(dǎo)HMGB1的釋放從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)[11,12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)尼古丁能抑制由內(nèi)毒素或TNF-α誘導(dǎo)HMGB1的釋放，并提高膿毒癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷纳媛省MPs是一類(lèi)能促進(jìn)骨形成和再生的誘導(dǎo)劑，屬于TGF-β超家族,其中BMP2是研究的熱點(diǎn)，它可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，在骨折愈合的早期發(fā)揮了重要的成骨作用[14-16]。Wu等[17]研究發(fā)現(xiàn)低功率激光照射能誘導(dǎo)BMP2促使小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。董萬(wàn)濤等[18]對(duì)脛骨骨缺損兔模型的研究發(fā)現(xiàn)，消定膏促進(jìn)骨缺損愈合的機(jī)制與TGF-β/BMPs信號(hào)通路有關(guān)。

表1 顱骨骨缺損模型大鼠骨組織中HMGB1和BMP2的表達(dá)水平Table 1 Expression levels of HMGB1 and BMP2 in bone tissue of rats with cranial bone defect

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05；與本組第28天比較,#P<0.05

麝香具有開(kāi)竅醒神、活血通經(jīng)、消腫止痛之功效[19]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，麝香主要含大環(huán)化合物、甾體化合物、多肽蛋白質(zhì)類(lèi)化合物等，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)等有廣泛的生理活性[20,21]。本次研究發(fā)現(xiàn)，麝香可促進(jìn)HMGB1、BMP2在骨缺損處骨組織中的表達(dá)，在第7 d時(shí)HMGB1和BMP2的表達(dá)最高，隨后依次降低，說(shuō)明麝香在骨缺損的愈合過(guò)程中發(fā)揮了作用，促使相關(guān)的因子向骨缺損處的遷移，那么，麝香是否能夠促進(jìn)更多的細(xì)胞因子的表達(dá)以及通過(guò)哪些途徑遷移至骨缺損處有待進(jìn)一步的研究。