補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠鈣沉積的影響

周廣文 向楠* 周亞娜 胡婭 曾明星 李家圓

1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065 2. 湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061 3. 長江大學(xué)，湖北 荊州 434023

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是以骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病[1]。骨強(qiáng)度包括骨密度和骨質(zhì)量兩個(gè)方面，其中正常的骨礦化對(duì)維持骨強(qiáng)度具有重要的作用。在OP的發(fā)病過程中，骨代謝異常與骨礦化異常往往互為因果。近10余年來，大量研究證實(shí)中醫(yī)藥治療OP有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2]，可以提高骨密度、改善疼痛。而我們的課題組多年來從事補(bǔ)腎化痰方防治OP的臨床與基礎(chǔ)研究[3,4]，通過前期的一系列研究證實(shí)了從痰論治骨質(zhì)疏松的可行性[5]。此外，我們認(rèn)為從痰論治骨質(zhì)疏松還可以從調(diào)節(jié)鈣沉積入手[6]。因此，本研究旨在探討補(bǔ)腎化痰方對(duì)骨鈣相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)一步明確其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1藥物制備：補(bǔ)腎方：菟絲子30 g、淫羊藿10 g、補(bǔ)骨脂15 g；補(bǔ)腎化痰方：菟絲子30 g、淫羊藿10 g、補(bǔ)骨脂15 g、全瓜蔞15 g、紅曲12 g、山楂20 g。生藥均由湖北省中醫(yī)院門診部藥房提供，加水煎煮濃縮而成，貯存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2試劑：大鼠Fetuin-A試劑盒(貨號(hào)JYM1043Ra)、MGP試劑盒(貨號(hào)JYM1036Ra)；大鼠Fetuin-A抗體(貨號(hào)Ab203582)、大鼠MGP抗體(貨號(hào)Ab192396)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6月齡雌性 SD 大鼠，SPF 級(jí)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，許可證號(hào)SCXK(鄂)42000600017470。

1.1.4儀器：MK3 酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司)、Tanon-5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能公司)、RM2235石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)、uCT50(瑞士 SCANCO MEDICAL)

1.2 方法

1.2.1去卵巢大鼠模型的建立和分組：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎化痰方組。除假手術(shù)組外，其他各組行卵巢切除術(shù)。按照(30 mg/ kg體重)的比例，使用麻醉藥物(1%戊巴比妥鈉)腹腔注射麻醉。無菌條件下，大鼠俯臥位固定，在背側(cè)正中切口進(jìn)入腹腔，在腎下極附近找到卵巢，用4號(hào)線結(jié)扎并摘除雙側(cè)卵巢，分層縫合切口。假手術(shù)組術(shù)式相同，但只切除卵巢周圍與雙側(cè)卵巢重量等同的脂肪組織，保留卵巢。術(shù)后5 w開始灌胃給藥。補(bǔ)腎組以0.51 g/mL中藥藥液灌胃，補(bǔ)腎化痰組以0.94 g/mL中藥藥液灌胃，模型組和假手術(shù)組灌以等體積的生理鹽水，1 mL/100 g，每天1次，給藥時(shí)間為8 w。期間各組大鼠分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2骨密度檢測：四組大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，取出每只大鼠左側(cè)股骨，固定在Micro-CT 載物臺(tái)上對(duì)股骨近干骺段進(jìn)行 X 射線掃描。沿大鼠股骨長軸方向掃描股骨遠(yuǎn)端，以 360°掃描角度、15 μm 的掃描分辨率，獲取連續(xù)的平面μCT 圖像。掃描完成后，選取感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)進(jìn)行三維重組，本次研究以生長板遠(yuǎn)端 1.0 mm、層厚 2. 0 mm 的骨組織作為松質(zhì)骨ROI，設(shè)定最低閾值為 170，提取圖像信息。獲取重組圖像后，使用 Micro-CT 自帶的軟件進(jìn)行定量分析。主要檢測參數(shù)包括骨密度BMD等。

1.2.3血清Fetuin-A、MGP檢測：12 w末，大鼠摘除雙側(cè)眼球取血，置于肝素抗凝管內(nèi)，于30 min內(nèi)3 000 r/m離心10 min，取上清，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。血清Fetuin-A、MGP水平采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測，測定參照試劑盒說明。

1.2.4骨組織Fetuin-A、MGP檢測：右側(cè)股骨洗凈后取部分骨片放入組織保存液中于4 ℃保存，提取蛋白，用Western blot法檢測骨組織Fetuin-A、MGP蛋白的表達(dá)，其余部分放入4%多聚甲醛固定液中固定，脫鈣，免疫組化檢測其定位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

大鼠在麻醉3～4 h后完全清醒，正常進(jìn)食。24 h后切口無紅腫，可正?；顒?dòng)；72 h后切口無感染征象。1 w后切口完全愈合，縫線脫落。

2.2 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠骨密度及血清指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組、補(bǔ)腎化痰組及補(bǔ)腎組的BMD、Fetuin-A、MGP 水平明顯降低。補(bǔ)腎化痰方和補(bǔ)腎方都能顯著提高去卵巢大鼠BMD、血清Fetuin-A、MGP(P<0.001)，但兩組間比較，BMD差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而補(bǔ)腎化痰方改善血清Fetuin-A、MGP水平的作用強(qiáng)于補(bǔ)腎方(P<0.001)。 見表1。

表1 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠骨密度及血清指標(biāo)的影響Table 1 Effect of nourishing kidney and dissipating phlegm prescription on BMD and serum indexes

注：與假手術(shù)相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與補(bǔ)腎化痰組相比，△P<0.05，&P>0.05

2.3 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠骨組織Fetuin-A、MGP水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、補(bǔ)腎化痰組及補(bǔ)腎組的骨組織Fetuin-A水平明顯降低，MGP水平明顯升高(P<0.001)；補(bǔ)腎化痰方和補(bǔ)腎方均能提高去卵巢大鼠骨組織Fetuin-A水平而降低MGP的水平(P<0.001)，但兩相比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表2、圖1)。

表2 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠骨組織指標(biāo)的影響Table 2 Effect of nourishing kidney and dissipating phlegm prescription on bone tissue indexes

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與補(bǔ)腎化痰組相比，&P>0.05

圖1 各組大鼠骨組織中fetuin-A和MGP 的蛋白印記圖Fig.1 Electrophorogram of fetuin-A and MGP of the bone tissue of rats in each group

IHC的結(jié)果顯示Fetuin-A的陽性表達(dá)位于骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞漿及骨小梁周邊的成骨細(xì)胞，MGP的陽性表達(dá)位于骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞漿和骨小梁周邊的成骨、破骨細(xì)胞表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7](圖2、3)。

圖2 各組大鼠骨組織中Fetuin-A 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.2 Immunohistochemical staining of fetuin-A in the bone tissue of rats in each group

圖3 各組大鼠骨組織中MGP 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining of MGP in the bone tissue of rats in each group

3 討論

在OP的發(fā)病過程中，伴隨著骨代謝的異常如速率的下降和增快，都會(huì)產(chǎn)生一定的骨量丟失，而這部分骨量丟失會(huì)通過生物體自身的激素調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生對(duì)鈣/磷分布的影響，從而導(dǎo)致鈣沉積異常的發(fā)生，因此，骨代謝異常與骨礦化異常，往往互為因果，共同影響OP的發(fā)病。病理狀態(tài)下，鈣從骨組織流失而異常沉積于其他部位，是OP發(fā)生與加重的原因之一。

生物體內(nèi)的礦化是具有選擇性的，鈣在骨骼、牙齒、生長板軟骨等硬組織的沉積屬于正常的生物礦化過程，而鈣在血管，腎臟，關(guān)節(jié)軟骨和心血管組織等軟組織的沉積鈣化則屬于病理性的異位礦化[8]。顯然在維持正常的生物礦化的過程中，同時(shí)存在著礦化促進(jìn)機(jī)制與抑制機(jī)制，兩者同等重要[9]。在血液中，F(xiàn)etuin-A可與MGP鈣、磷等礦物質(zhì)前體結(jié)合形成復(fù)合體[10]，即胎球蛋白-基質(zhì)gla蛋白-鈣磷礦化復(fù)合物(Fetuin A-MGP-Calcium phosphate mineral complex，F(xiàn)MC)。血液中FMC的形成，能夠防止礦物離子的聚積，維持其穩(wěn)定；并且可以通過從細(xì)胞外液中，將逐漸成熟且不可溶的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)移到目的礦化位點(diǎn)，使得礦化的反應(yīng)鏈繼續(xù)發(fā)展[11]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)相比，去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的血清Fetuin-A及血清MGP水平均降低，這與我們的前期臨床研究結(jié)果一致[12]。OP時(shí)，破骨細(xì)胞功能活躍，骨組織的鈣離子大量外流，血清中鈣離子增多，但此時(shí)血清Fetuin-A、MGP水平降低，F(xiàn)MC的合成是減少的。因此血清中的鈣離子得不到穩(wěn)定而大量聚集在異位鈣化區(qū)，從而影響了正常的骨礦化過程。

基質(zhì) Gla 蛋白(matrix gla protein，MGP)是礦鹽沉積的重要抑制物，是體內(nèi)研究中首次報(bào)道的血管和軟骨鈣化的抑制劑[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在血管鈣化的過程中，MGP可與BMP2結(jié)合，抑制BMP2的表達(dá)[14,15]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織MGP表達(dá)是增多的。我們推測骨組織中MGP的表達(dá)增多，一方面可能會(huì)抑制骨組織鈣鹽的沉積，另一方面可能通過抑制BMP2的表達(dá)，影響成骨細(xì)胞的分化與成熟，從而影響OP的發(fā)生。

中醫(yī)認(rèn)為OP/PMOP屬于“骨痿”、“骨痹”等范疇，現(xiàn)代學(xué)者普遍認(rèn)為其發(fā)生與腎精虧損、脾胃虛弱、肝血虧虛、瘀血阻絡(luò)4個(gè)因素有關(guān)[16]，并多從這幾個(gè)方面入手，辯證施治[17]。而我們的課題組基于對(duì)痰濁在OP發(fā)病中作用的認(rèn)識(shí)，結(jié)合“腎主骨，生髓”的中醫(yī)基礎(chǔ)理論，提出了“脂代謝異?？赡芘c骨質(zhì)疏松癥痰濁有關(guān)”的假說，制定了補(bǔ)腎化痰的新治則，從“痰”論治骨質(zhì)疏松[5]，并進(jìn)行一系列的前期研究[18-21]。此外，根據(jù)正常的鈣代謝在人體內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)作用及鈣的異常沉積引起的病理表現(xiàn)[22]，我們認(rèn)為，鈣的異常沉積應(yīng)屬于中醫(yī)“痰”的范疇。因此，從痰論治骨質(zhì)疏松，還可以從調(diào)節(jié)骨礦化及異位鈣化的角度入手[6]，通過對(duì)骨鈣相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，促進(jìn)正常的骨礦化而抑制異位鈣化，從而達(dá)到治療OP的目的。而本次研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎化痰方均可以提高去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠的BMD，提高血清FMC的表達(dá)，并降低骨組織MGP的表達(dá)，我們認(rèn)為中藥改善OP的作用在于一方面促進(jìn)FMC的表達(dá)，使得血中的鈣離子得到穩(wěn)定，能夠參與正常的鈣化過程，從而促進(jìn)正常骨礦化的進(jìn)行；另一方面通過減少M(fèi)GP在骨組織局部的聚集，降低MGP對(duì)骨礦化的抑制作用。兩組間比較，補(bǔ)腎化痰方的作用優(yōu)于補(bǔ)腎方，表明其對(duì)鈣化過程的影響主要與其化痰功能有關(guān)。

本次研究僅對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠的骨組織進(jìn)行了研究，探究了FMC對(duì)骨礦化的影響，沒有能夠同時(shí)研究異位鈣化的部位，如血管鈣化的變化，因此FMC在機(jī)體整體的作用變化還有待進(jìn)一步的研究。