基于網絡藥理學和生物信息學補腎活血膠囊抗骨質疏松的分子機制分析

梁學振許波李剛蓋帥帥閻博昭李嘉程夏聰敏

山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨組織微結構異常及骨脆性增加為特征的全身性代謝性骨病[1-2]。目前，防治OP的主要手段包括藥物干預、飲食調控和運動療法。西藥通常包括骨吸收抑制劑、骨形成促進劑和骨礦化物等三大類[3]，但往往局限于改善臨床癥狀，延緩病情進展且靶向性不強，因此亟需探尋新的思路解決上述問題[4]。中醫(yī)藥在辯證論治原則的指導下結合分期治療在防治OP方面取得了顯著的療效[5-7]，現代藥理學研究表明，補腎活血類中藥不但可以提高腸鈣吸收、促進成骨細胞礦化、增強細胞成骨性活性、抑制破骨細胞的形成等綜合功效[8-9]，而且與西藥單向調控機制相比，治療調控存在雙向化，調節(jié)效應更具優(yōu)勢[10]。

補腎活血膠囊是山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨傷科名中醫(yī)李剛教授在多年的臨床實踐中，結合中醫(yī)學“腎主骨生髓”的經典理論歸納總結而成，其主要成分為鹿角膠、丹參、川芎、杜仲、淫羊藿、香附、白芍、茯苓、牛膝、甘草，諸藥合用共奏補腎壯筋，活血止痛之功。臨床研究表明[11-13]，補腎活血膠囊對于OP具有較好的臨床療效，但其藥效物質基礎和分子機制至今尚不明確。因此，挖掘補腎活血膠囊的入血活性成分和作用靶點，分析其可能的作用機制，對于補腎活血膠囊的科學內涵的闡述和其臨床推廣應用具有重要的促進作用。目前針對中藥復方方面的研究僅僅通過現有的手段往往具有檢測靈敏度低、可靠評價指標少等問題而難以科學、有效、全面地闡釋其作用機制。隨著網絡藥理學和生物信息學理論的建立，為研究中藥復方潛在活性成分和作用靶點提供了有效的研究策略。本文通過藥物口服生物利用度(oral bio-availability，OB)、藥物相似性(drug-likeness，DL)等參數對補腎活血膠囊中已報道的所有成分進行系統(tǒng)的篩選以預測其可能靶點，同時檢索疾病基因相關數據庫和分析GEO芯片挖掘與骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展相關的已知與潛在的靶點，借助網絡拓撲分析的手段，進一步預測補腎活血膠囊治療OP的作用靶點，對靶點進行富集分析，探討其可能的作用機制。

1 方法

1.1 補腎活血膠囊中活性成分的篩選和靶點預測

中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)中收錄了約505味中藥和約12144相關中藥成分，并詳細地描述了每一個成分的毒藥物動力學(absorption and distribution and metabolism and excretion, ADME)參數，包括OB、DL、Caco-2細胞滲透性、半衰期、血腦屏障、脂水分布系數等。本研究通過檢索TCMSP數據庫對補腎活血膠囊所有成分進行初步篩選，其中篩選條件為 OB≥30%，DL≥0.18；同時，將獲取的活性成分與前期研究結果及相關文獻結合分析，并采用 TCMSP 靶點預測模型預測相關活性成分可能的作用靶點。

1.2 補腎活血膠囊“活性成分-靶點網絡”構建

本研究通過網絡圖像化軟件 Cytoscape 3.2.1進行補腎活血膠囊“活性成分-靶點網絡”的構建和分析，將上述獲得的活性成分及靶點導入軟件進行相關網絡構建，其中用“節(jié)點”(node)表示分子、靶蛋白，用“邊”(edge)表示成分與靶點之間的關系；采用network analyzer插件進行網絡特征分析以明確補腎活血膠囊中較為重要的成分和靶點，同時閱讀相關文獻以分析其中的相互作用。

1.3 GEO 芯片數據分析OP相關靶點

從GeneExpression Omnibus數據庫中下載編號為：GSE7429的芯片數據原始文件，該芯片數據的原始文件主要針對20位絕經后骨密度(bone mineral density, BMD)高低不同女性血液的基因表達譜的基因測序，其中低BMD10個和高BMD10個。本研究利用robust multiarray average(RMA)算法對其原始文件進行了背景校正和矩陣數據歸一化處理，同時采用limma包對芯片數據進行二次分析，并結合P值和差異倍數(fold change，FC)進行相關數值的篩選，其中將P<0.01，FC>1.5作為顯著差異基因的篩選條件。

1.4 已知的OP相關疾病靶點檢索

在TTD、DrugBank數據庫、OMIM數據庫、GAD和PharmGKB等5個數據庫中利用“osteoporosis”作為關鍵詞進行已知的疾病靶點的檢索及篩選。刪除檢索結果中重復的靶點以獲得OP發(fā)病過程已知的靶點。

1.5 蛋白質相互關系網絡構建和關鍵靶點篩選

本研究將補腎活血膠囊上述的作用靶點和OP相關的疾病靶點分別映射到蛋白質相互作用關系網絡中，利用BisoGenet插件對2個蛋白質相互作用關系網絡進行繪制，將繪制得到的2個蛋白質相互作用關系網絡圖采用cytoscape進行合并，抽取其交集網絡，即為補腎活血膠囊治療OP的直接和間接靶點調控網絡。

跟蹤相關文獻并借助自由度、中心中介性、特征向量中心性、緊密度、網絡中心性和局部邊連通性等指標，采用網絡拓撲分析插件CytoNCA篩選出自由度大于所有節(jié)點自由度中位數2倍的節(jié)點(Big hubs)；然后，篩選網絡中的關鍵節(jié)點再篩選其他幾個指標大于所有節(jié)點中位數的節(jié)點，即關鍵基因。上述獲得的相關活血成分及靶點則有可能是直接、間接調控這些節(jié)點，發(fā)揮抗骨質疏松的作用。

1.6 Pathway 富集分析

本研究采用ClueGO分析插件對上述OP的關鍵靶點及獲得的信號通路進行富集分析，并根據重要程度繪制信號通路占比餅狀圖；其中ClueGO展示的圖像中同一種顏色的節(jié)點代表同一類型的信號通路，節(jié)點的大小代表了該信號通路的顯著性，信號通路的顯著性越高節(jié)點越大，說明該通路的重要性越高。

2 結果

2.1 補腎活血膠囊活性成分篩選與ADME分析

本研究通過檢索TCMSP數據庫補腎活血膠囊中所有的已報道的成分及其 ADME參數共搜集到1 186個相關成分。根據OB和DL參數共篩選出249個入血的活性成分(圖 1)。利用相關靶點預測技術對上述活性成分進行作用靶點預測，排除重復靶點，共獲得145個預測靶點。

圖1 根據ADME參數篩選出的補腎活血膠囊活性成分分布圖。A： 符合篩選標準的補腎活血膠囊成分；B： 符合篩選標準的補腎活血膠囊各藥成分比例Fig.1 ADME parameters distribution of active ingredients in BuShenHuoXue capsule. A： Components that meet the criteria for screening in BuShenHuoXue capsule; B： Component ratio in accordance with the screening conditions in each herb in BuShenHuoXue capsule

圖2 補腎活血膠囊活性成分-靶點網絡圖Fig.2 Compound-target network of BuShenHuoXue capsule

2.2 補腎活血膠囊“活性成分-靶點網絡”構建和分析

采用網絡圖形化工具Cytoscape將上述活性成分及預測靶點繪制出潛在活性成分和作用靶點的關系網絡并加以分析，查找網絡中的關鍵節(jié)點，以確定補腎活血膠囊中發(fā)揮重要作用的成分和靶點。結果如圖2所示，通過cytoscape網絡構建共獲得201個節(jié)點和982個關系。分析可知，木犀草素、槲皮素、谷甾醇和山奈酚等有效成分與網絡中的多個靶點相互作用，而PPARG、ESR1、AR等靶點也能作用于多個有效成分。“活性成分-靶點網絡”分析顯示，補腎活血膠囊的有效成分之間存在協同，而協同調控的靶點同時在OP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同程度的作用。

2.3 OP相關基因分析和檢索

2.3.1OP相關差異表達基因分析：二次挖掘分析GEO芯片數據庫的基因芯片共獲取124個明顯影響和改變的基因，結合相關文獻探究和分析這些明顯改變的基因與補腎活血膠囊的作用靶點和OP及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的相關關系。差異表達基因熱圖見圖3。

圖3 差異表達基因熱圖Fig.3 Different expression genes of osteoporosis

2.3.2數據庫檢索已有OP相關靶點：本研究檢索了5個國際公認的疾病基因相關數據庫，搜集前期研究和報道的與OP發(fā)生發(fā)展密切相關的已知的相關靶點基因，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 分別檢索到44、0、57、295、10個靶點，刪除重復靶點，共檢索到356個已知的OP發(fā)病過程中相關的靶點。

2.4 補腎活血膠囊治療OP的蛋白相互作用網絡構建與關鍵靶點篩選

2.4.1補腎活血膠囊治療OP的蛋白相互作用：網絡構建機體的內在調控往往是復雜的調控網絡，而不是單一的信號通路支配；不同的信號通路和靶點之間會存在一定程度的信號轉導，故藥物的治療作用不僅表現為成分靶點的直接結合，還表現為直接調控靶點與間接調控其他靶點相結合的調控方式。通過蛋白質相互作用關系數據的挖掘為尋找靶點的直接、間接調控作用關系提供了可能。本研究通過蛋白質相互作用網絡的構建，挖掘出補腎活血膠囊與之產生直接或間接作用的靶點共6444個，而靶點相互之間的相互聯系多達146287種。與此同時，繪制與OP相關靶點的蛋白質相互作用網絡，也挖掘出6129個直接或者間接相關的靶點。本研究進一步深入分析補腎活血膠囊影響OP發(fā)生發(fā)展中的靶點，繪制蛋白質相互作用靶點網絡，為網絡分析和機制的探討提供了可能。

2.4.2補腎活血膠囊治療OP的關鍵：本研究為進一步尋找網絡中關鍵節(jié)點，獲得更多節(jié)點的傳遞信息和更高的節(jié)點信息傳遞效率，對補腎活血膠囊調控OP的蛋白質相互作用交集網絡和網絡節(jié)點的拓撲屬性分析進行篩選。通過網絡拓撲分析，本研究共發(fā)現關鍵節(jié)點229個。篩選策略示意圖見圖4。

圖4 補腎活血膠囊關鍵節(jié)點的目標篩選策略圖Fig.4 Target screening strategy for key nodes in BuShenHuoXue capsule

2.5 補腎活血膠囊治療OP的機制分析

本研究利用ClueGO分析上述229個關鍵節(jié)點，挖掘其參與的主要信號通路，研究補腎活血膠囊治療OP可能的作用機制。分析結果顯示，補腎活血膠囊除與直接作用于OP關鍵節(jié)點涉及的信號通路，如Wnt信號通路、TGF-β信號通路和Notch信號通路等有關，還對P13 K-AKT信號通路、VEGF信號通路和甲狀腺素信號通路等同時進行調控。見圖5。

圖5 補腎活血膠囊治療骨質疏松癥信號通路分析圖Fig.5 Results of signal pathway analysis of BuShenHuoXue capsule in treatment of Osteoporosis

3 討論

隨著全球人口數量的快速增長和人口老齡化的不斷加減，OP患者人數增長率也隨之提供，但目前在防治OP方面仍沒有一種行之有效的治療手段。骨吸收抑制劑、骨形成促進劑和骨礦化物等西藥在抗OP進展方面發(fā)揮了重要的作用，但長時間應用尤其是雙膦酸鹽的安全性問題越來越受到重視[14]，而抗OP新藥的研發(fā)工作仍在進行[15]。隨著中醫(yī)藥的不斷繼承與創(chuàng)新，中藥在防治OP方面優(yōu)勢正不斷被挖掘與研究。

中醫(yī)古籍文獻中并沒有“骨質疏松癥”這一病名，但根據其臨床證候歸屬于中醫(yī)學“骨痿”“骨枯”“骨極”范疇，認為其與腎、脾、瘀關系密切，基本病機為腎虧為主，脾虛為輔，血瘀則為促進因素[16]。腎主骨生髓、為先天之本，骨的生長、發(fā)育及衰弱均與腎精盛衰關系緊密，故治療重在補腎。跟蹤文獻，補腎類中藥單體及復方的抗骨質疏松作用已被證實[17-18]。補腎活血膠囊是山東省知名專家在整體觀念和辨證論治為特色的中醫(yī)基礎理論指導下結合分期治療歸納總結而成的臨床經驗方，在補肝腎、強筋骨等方面展現出良好的臨床療效。本研究利用網絡藥理學和生物信息學的技術對補腎活血膠囊的入血活性有效成分進行篩選，對其可能的作用靶點進行預測，對其蛋白質相互功能網絡進行構建與分析，闡明了補腎活血膠囊治療OP的直接和間接調控靶點和可能的作用機制。

從富集結果分析可知，補腎活血膠囊抗骨質疏松的分子機制主要與直接和間接調節(jié)骨代謝兩類信號通路相關。(1)直接影響骨代謝。OP發(fā)生發(fā)展過程中重要的發(fā)病機制是骨吸收和骨形成過程中的動態(tài)平衡狀態(tài)發(fā)生異常，故直接影響骨代謝的相關信號通路是調控OP發(fā)生發(fā)展過程中主要的信號通路，主要富集在MAPK信號通路、Wnt信號通路、TGF-β信號通路、Notch信號通路、雌激素受體信號通路和破骨細胞分化通路等。MAPK信號通路對細胞的增殖、分化進行調控，進而發(fā)揮相應的生物作用，在維持骨代謝平衡方面具有重要作用[19]。TGF-β信號通路能通過調節(jié)由間葉細胞衍生而來的前體細胞來促進其分別向軟骨細胞、成骨細胞分化，抑制破骨細胞的活性[20-21]。Notch信號通路在成骨細胞分化過程的早期階段表達時誘導成骨細胞中骨保護素的表達抑制成骨細胞向成熟成骨細胞表型和成骨細胞功能發(fā)展而抑制破骨細胞形成和骨吸收[22]。(2)間接影響骨代謝。在顯著富集的信號通路中仍存在部分調控其他系統(tǒng)的信號通路，如P13 K-AKT信號通路、甲狀腺素信號通路、心肌收縮信號通路和VEGF信號通路等。體內代謝之間是相互作用、相互聯系的，通過全身其他系統(tǒng)，如循環(huán)系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等多種代謝可以間接影響或干預骨微環(huán)境。

通過上述通路富集結果顯示，網絡集群信號通路中也包括EB病毒感染、DNA復制、泛素介導的蛋白水解、前列腺癌、酒精中毒、內質網中的蛋白加工等。說明補腎活血膠囊不僅能直接作用于骨代謝相關信號通路，而且還可以通過影響體內多種代謝途徑的靶點發(fā)揮抗OP作用。故補腎活血膠囊抗OP的主要機制是促進成骨細胞的增殖或抑制破骨細胞的活性以及對活性成分進行雙向調節(jié)；同時，結果還提示相關通路之間在一定程度上存在多種多樣的相互聯系，在治療OP不僅要針對局部關鍵通路，而且需要針對疾病可能的病因，機體所處的環(huán)境采用多靶點、多方向、多系統(tǒng)的干預。上述結果與中醫(yī)藥治療疾病的特點恰恰相吻合，治病求本、標本兼治，同時也為中醫(yī)藥治療疾病多靶點、多方面的可行性和優(yōu)勢提供了有利證據。

基于網絡藥理學和生物信息學分析藥物與疾病靶點的相互網絡關系能有效地闡明補腎活血膠囊治療OP的疾病機制，為后續(xù)進一步的探討分子機制和優(yōu)化實驗設計等提供了重要的理論基礎，使實驗研究更加合理化和可行化。另外，本研究也為藥物與疾病的相關機制的研究提供了新的思路和方法，尤其是診斷中藥復方與某種特定疾病的分子機制分析。