• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miRNA在絕經(jīng)后骨質疏松癥腎陰虛證中的表達譜特征及生物信息學分析

    2018-08-02 02:36:18謝麗華陳娟謝冰穎許惠娟陳賽楠葉云金葛繼榮
    中國骨質疏松雜志 2018年6期
    關鍵詞:差異信號研究

    謝麗華 陳娟 謝冰穎 許惠娟 陳賽楠 葉云金 葛繼榮

    福建省中醫(yī)藥研究院骨質疏松證候基因組學重點研究室,福建 福州 350003

    絕經(jīng)后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是常見的老年性疾病,發(fā)病率高。中醫(yī)藥能顯著改善骨質疏松癥癥狀、防治并發(fā)癥、提高生存質量和延長壽命等。但是中醫(yī)藥強調其基本理論及原理的闡述,對現(xiàn)代疾病生物學本質的探索不足,如能在生物學層面運用現(xiàn)代生物學技術對中醫(yī)證候的實質進行深入的闡述,這將更有利于中西醫(yī)的溝通與結合。表觀遺傳學是當前研究的一個熱點,它能很好地闡述“遺傳-環(huán)境-疾病”相互作用機制和關系,而這種“環(huán)境疾病”模式與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中“天人合一”的整體觀相符。所以將表觀遺傳學的概念及相關技術引入到中醫(yī)基礎理論的研究會有所突破,并有新發(fā)現(xiàn)的可能。

    miRNA作為表觀遺傳學主要研究的內容之一,主要作用環(huán)節(jié)在基因轉錄后進行調控。miRNA是一類存在于真核生物體內,長22~25 bp的內源性非編碼單鏈RNA分子,通過與靶基因的特異性堿基配對引起靶序列降解或翻譯阻遏,從而對靶基因的表達進行轉錄后水平的調控[1-3]。研究表明miRNA參與生命過程中一系列的重要進程,包括細胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育等多種生物學過程[4]。課題組前期已經(jīng)多次應用全基因組表達譜芯片技術開展證候-基因組研究,發(fā)現(xiàn)腎陰虛證主要集中于代謝、免疫功能類基因的表達異常[5-7]。在此系列研究的基礎上,本實驗選擇為基因調控環(huán)節(jié)的miRNA,計劃在沿用病癥結合的研究思路基礎上,采用miRNA芯片,觀察PMOP腎陰虛證的miRNA表達變化情況,旨在為闡明PMOP腎陰虛證的本質及為治療提供新的思路與方法。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    采用病例對照研究方法,選擇絕經(jīng)后2年以上、75歲以下的受試者,對受試者進行問卷調查,檢測肝腎功能、血尿常規(guī)、心電圖和B超等。雙能X線骨密度儀檢測正位腰椎L1~4和左側股骨上端骨密度,中醫(yī)辨證,分組如下:PMOP腎陰虛組3例,PMOP腎陽虛組3例,健康絕經(jīng)后婦女3名作為對照組。本研究方案獲得福建省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)藥臨床研究倫理委員會審批通過。(1)診斷標準:骨質疏松癥診斷參照《中國人骨質疏松癥建議診斷標準》(第2稿)[8],中醫(yī)證候診斷標準參照《中醫(yī)虛證辨證參考標準》[9]。(2)納入標準:符合骨質疏松癥診斷標準;符合中醫(yī)辨證標準;年齡在46~75歲,自然絕經(jīng)2年以上的漢族婦女;受試者知情同意。(3)排除標準:不符合骨質疏松癥診斷及中醫(yī)腎陰虛證辨證標準者;類風濕性關節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進等繼發(fā)性骨質疏松癥者;合并有心腦血管嚴重疾病者;肝、腎功能檢查異常者;最近一個月用過中藥治療骨質疏松癥者,或近3個月內用激素替代治療、使用降鈣素者,或近6個月內有連續(xù)15 d用雙膦酸鹽等防治骨質疏松癥者。

    1.2 用miRNA芯片技術檢測miRNA表達譜及篩選差異表達基因

    1.2.1樣品RNA提取和質檢:取外周血5 mL,淋巴細胞分離液提取靜脈血中的單個核細胞,使用Trizol法提取細胞的總RNA,Nanodrop測定RNA 260/280的吸光度及濃度,用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。

    1.2.2芯片雜交及掃描:基因芯片使用Agilent miRNA芯片,委托北京博奧生物技術有限公司進行。對Total RNA進行純化,純化后重新定量。Total RNA 的去磷酸化、標記、雜交,在洗液中清洗甩干后,使用 Agilent 芯片掃描儀對芯片進行掃描,得到雜交圖片。

    1.2.3圖像采集和數(shù)據(jù)分析:使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù),然后使用Agilent Gene Spring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析?;跀?shù)據(jù)庫KEGG查詢差異涉及miRNA的信號通路,及相關靶基因數(shù)據(jù)庫分析序列以及預測靶基因。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計,計量資料用均數(shù)±標準差表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 受試者數(shù)量分析

    納入對象9人均進入結果分析,無中途退出者。

    2.2 PMOP腎陰虛證組與其他2組miRNA表達譜的差異性分析

    PMOP腎陰虛證組與對照組相比,篩選差異表達miRNA49條;PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽虛證組相比,篩選差異表達miRNA71條;PMOP腎陰虛證組分別與其他2組比較,有20條共同的差異表達miRNA,與正常對照組相比,其中表達上調的miRNA有17條,表達下調的miRNA有3條(見表1)。

    表1 PMOP腎陰虛證組與其他2組比較共同差異表達miRNATable 1 Differential expression of miRNA in Kidney Yin deficiency group compared with the other two groups

    2.3 實時熒光定量PCR驗證芯片結果

    根據(jù)miRNA表達譜芯片檢測的結果,隨機選取3個表達變化顯著的miRNA (hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p)用實時熒光定量PCR再次驗證,內參選擇snRNAU6。結果顯示(圖1),與對照組相比,PMOP腎陰虛組hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p表達水平明顯升高(FC=3.56、4.20),hsa-miR-95-3p表達明顯下調(FC=2.10),3條miRNA在芯片樣本中得到較好的驗證,qPCR的結果與芯片數(shù)據(jù)趨勢一致。

    圖1 定量PCR驗證基因芯片的結果Fig.1 Confirmation of microarray results using quantitative PCR

    2.4 差異表達miRNA的pathway分析

    將差異表達的miRNA用KEGG數(shù)據(jù)庫進行pathway分析,選取前30個顯著富集的kegg通路,根據(jù)P值繪制成柱狀圖(圖2),主要包括代謝通路、癌癥通路、Rap1信號通路、粘著斑信號通路、PI3K-Akt、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、內質網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號通路、Ras信號通路、Wnt信號通路。

    2.5 差異表達miRNA的靶基因預測

    為了更全面地了解PMOP腎陰虛證相關miRNA的功能,同時采用miRWalk、Microt4、miRanda、miRdb、miRMap、PicTar2、PITA、RNA22、Targetscan、RNAhybrid 10個數(shù)據(jù)庫逐一預測這20個miRNA的靶基因,進行綜合統(tǒng)計分析,最終結果取6個數(shù)據(jù)庫預測結果的重疊部分,為了進一步縮小靶基因預測范圍,從結果中挑選出同時被5個miRNA同時作用的靶基因,共9個(見表2)。

    3 討論

    隨著對miRNA功能研究的深入,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關。miRNA在細胞生長和發(fā)育過程中起多種作用。許多miRNA被證明在骨代謝中都起到了關鍵的調控作用,參與維持骨代謝的平衡。例如miR-133 a和miR-204通過抑制成骨分化中關鍵的轉錄因子Runx2,抑制成骨細胞分化[10-11];有些miRNA在骨重建過程中有雙重作用,如miR-214既能促進破骨細胞形成,同時也能抑制骨形成[12-13]。對這些miRNA的深入研究可以為骨代謝的疾病診斷與治療提供新的思路與方法。本研究以miRNA芯片技術為研究手段,通過探討PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽虛證組和健康絕經(jīng)后婦女3組miRNA基因差異的表達情況,揭示與PMOP腎陰虛證相關的miRNA表達譜特征,旨在整體miRNA表達水平闡明POP腎陰虛證的本質。研究結果發(fā)現(xiàn)腎陰虛證組與對照組、腎陽虛證組的差異表達miRNA分別為49條、71條;腎陰虛證組與其他兩組比較,篩選出20條共同差異表達miRNA,和對照組相比,其中表達上調的有17條,表達下調的有3條。隨后挑選hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p這3條miRNAs進行qPCR驗證,證實qPCR的表達數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)趨勢一致。

    圖2 顯著富集的kegg信號通路Fig.2 Significantly enriched kegg pathway

    表2 差異表達miRNA的靶基因預測Table 2 Target gene prediction results of differential expression of miRNA

    miRNA是機體中一個龐大復雜的調控網(wǎng)絡體系,對miRNA相關信號通路的研究是了解其調控機理的重要方式。筆者對這些差異miRNA進行根據(jù)pathway分析,發(fā)現(xiàn)這些miRNA主要參與代謝通路、癌癥通路、Rap1信號通路、粘著斑信號通路、PI3K-Akt、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、內質網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號通路、Ras 信號通路、Wnt信號通路的調控等。研究證實,這些信號通路的多條通路都參與了骨代謝的調控。PI3K-Akt信號通路廣泛存在于細胞中,能調控成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化及凋亡[14-15],Akt及其下游的靶基因是骨形成的關鍵調控者。Wu等[16]研究證實四物湯的提取物可以通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路促進骨形成進而防止骨質疏松。MAPK 信號通路主要包括 ERK1/2通路、JNK 通路、P38 通路和 ERK5通路。Kim等[17]的研究結果表明膠原蛋白水解物可以通過ERK/MAPK通路促進成骨細胞分化和增殖; Hah等[18]實驗說明JNK 通路在成骨細胞分化和生存中具有重要作用;Choi等[19]和Rodríguez-Carballo等[20]報道了P38通路可以通過促進骨形成和抑制破骨細胞分化改善骨質疏松。Wnt信號通路對成骨細胞的分化和骨形成具有重要的促進作用,它可以通過調節(jié)Runx2等成骨標志性基因的表達,促進成骨細胞分化[21]。此過程對于骨形成非常重要,當該通路紊亂時會導致骨質疏松。由于Wnt信號通路在成骨細胞中扮演著重要角色,已成為藥物設計的靶標,并被成功地應用于臨床。如Romosozumab藥物已經(jīng)完成臨床II期研究階段,目前正在進行III期臨床項目。Romosozumab是一種全人源化單克隆抗體,通過抑制骨硬化蛋白活性,激活Wnt通路而促進骨形成,從而促進成骨作用[22-23]??傊?,骨質疏松發(fā)病機制復雜,多種相關信號通路之間存在交互和交叉的作用,具體機制還需進一步深入研究。

    miRNA功能研究的重點在于對其靶基因調控的研究。miRNA通過精確地調控靶基因表達進而參與細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡等生物學過程。通過實驗結合生物信息學的方法,2009年Friedman等[24]預測,miRNA作用的靶基因數(shù)量超過45 000個,調控了人類2/3以上的蛋白質編碼基因。一個miRNA可以有不同的靶基因,一個靶基因也可以由多個miRNA調控。通常認為,受多個miRNA同時作用靶基因更有可能發(fā)揮重要作用[25]。筆者最終篩選出9個miRNA的靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148),其中SOX11、PHF20基因被認為與骨的生長、發(fā)育相關。SOX11基因在許多干細胞中都有表達,包括骨祖細胞,在細胞的發(fā)育過程中,SOX11基因對于細胞的存活和分化起了重要作用,并能通過誘導生長板的形成促進骨骼生長[26]。SOX11基因過表達可以顯著促進老鼠骨髓基質干細胞向成骨細胞分化[27],機制可能是通過促進成骨細胞重要的轉錄因子Runx2和OSX的表達,進而促進成骨分化[28]。大鼠全身性敲低PHF20基因會表現(xiàn)出腰椎發(fā)育異常[29],研究其發(fā)病的具體機制,Yang等[30]通過過表達PHF20基因,發(fā)現(xiàn)它可以增加ALP活性和骨礦化形成,及骨形成標志物Runx2的表達,進而促進成骨細胞分化。相反,抑制PHF20表達會降低骨形成及骨礦化作用。

    綜上所述,本實驗采用miRNA芯片技術研究PMOP腎陰虛證中差異表達miRNA,并對這些miRNA進行pathway分析及靶基因預測。結果表明,這些差異表達miRNA可能通過調控PI3K-Akt、MAPK、Wnt信號通路等與骨代謝相關信號通路參與PMOP腎陰虛證的發(fā)生發(fā)展過程。這只是對PMOP腎陰虛證miRNA基因表達譜的初步探討,今后需要擴大樣本驗證miRNA,及進一步探討miRNA與靶基因的關系,并對miRNA進行體內實驗功能驗證。通過對差異miRNA及其調控的靶基因深入研究,將有助于理解PMOP腎陰虛證的本質及為治療提供新的思路與方法。

    猜你喜歡
    差異信號研究
    相似與差異
    音樂探索(2022年2期)2022-05-30 21:01:37
    FMS與YBT相關性的實證研究
    遼代千人邑研究述論
    信號
    鴨綠江(2021年35期)2021-04-19 12:24:18
    完形填空二則
    視錯覺在平面設計中的應用與研究
    科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
    找句子差異
    EMA伺服控制系統(tǒng)研究
    生物為什么會有差異?
    基于FPGA的多功能信號發(fā)生器的設計
    電子制作(2018年11期)2018-08-04 03:25:42
    亚洲成人久久爱视频| 国产高清视频在线观看网站| 国产 一区精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本黄大片高清| 日本 av在线| 欧美性感艳星| 99热全是精品| 成人精品一区二区免费| 在线观看av片永久免费下载| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 禁无遮挡网站| 国产综合懂色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一区福利在线观看| 欧美激情在线99| 欧美3d第一页| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| a级毛片a级免费在线| 精品一区二区三区视频在线| 国产色婷婷99| 国产免费一级a男人的天堂| 我的女老师完整版在线观看| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产精品久久男人天堂| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 乱人视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲性久久影院| 日韩精品青青久久久久久| 成年女人永久免费观看视频| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 日日撸夜夜添| 最近手机中文字幕大全| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品乱码久久久久久99久播| 免费观看的影片在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩精品有码人妻一区| 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国内精品一区二区在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成人午夜高清在线视频| 如何舔出高潮| 大香蕉久久网| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av卡一久久| 亚洲美女搞黄在线观看 | 九色成人免费人妻av| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲内射少妇av| 午夜爱爱视频在线播放| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 免费看a级黄色片| 最近视频中文字幕2019在线8| 麻豆乱淫一区二区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 少妇被粗大猛烈的视频| 嫩草影院入口| 国产在线精品亚洲第一网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 有码 亚洲区| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美高清成人免费视频www| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲内射少妇av| 国产麻豆成人av免费视频| 麻豆一二三区av精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久精品欧美日韩精品| 免费在线观看成人毛片| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 男女视频在线观看网站免费| 国产 一区 欧美 日韩| 精品熟女少妇av免费看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 极品教师在线视频| 国产色婷婷99| 成年版毛片免费区| 在线a可以看的网站| 最近的中文字幕免费完整| 午夜激情福利司机影院| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 少妇人妻一区二区三区视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品久久久久久久久亚洲| 国国产精品蜜臀av免费| 免费搜索国产男女视频| 99热全是精品| 国产精品永久免费网站| 久久久久久久亚洲中文字幕| 91狼人影院| 精品一区二区三区人妻视频| 深夜a级毛片| 亚洲熟妇熟女久久| 中国美女看黄片| 少妇熟女欧美另类| 久久人妻av系列| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久人人爽人人片av| 国产在线精品亚洲第一网站| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美日韩在线观看h| 丰满乱子伦码专区| 能在线免费观看的黄片| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | av在线天堂中文字幕| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 国产黄a三级三级三级人| 免费在线观看成人毛片| h日本视频在线播放| 国产精品一及| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产成人一区二区在线| 一区福利在线观看| av女优亚洲男人天堂| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| av女优亚洲男人天堂| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久这里只有精品中国| 国产欧美日韩一区二区精品| av在线老鸭窝| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品一区二区性色av| a级一级毛片免费在线观看| 1000部很黄的大片| 亚洲av美国av| 高清毛片免费观看视频网站| 日本三级黄在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| av天堂在线播放| 亚洲熟妇熟女久久| 男人的好看免费观看在线视频| 日韩欧美国产在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 精品国产三级普通话版| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产熟女欧美一区二区| 十八禁网站免费在线| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲在线观看片| av在线蜜桃| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩欧美精品免费久久| 直男gayav资源| 亚洲av二区三区四区| 日日撸夜夜添| 欧美成人一区二区免费高清观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 欧美一区二区精品小视频在线| 精品久久国产蜜桃| 精品人妻熟女av久视频| 国内精品久久久久精免费| 国语自产精品视频在线第100页| eeuss影院久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 在线观看午夜福利视频| 在线播放国产精品三级| 尾随美女入室| 日本五十路高清| 国产乱人视频| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日本黄色片子视频| 精品久久久噜噜| 亚洲av五月六月丁香网| 国产 一区精品| 欧美一区二区亚洲| 最近在线观看免费完整版| 亚洲不卡免费看| 搞女人的毛片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久精品影院6| 99久久精品国产国产毛片| 精品日产1卡2卡| 日本熟妇午夜| 少妇的逼水好多| 人妻夜夜爽99麻豆av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩欧美精品免费久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲成人av在线免费| www.色视频.com| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲人成网站在线播| 亚洲国产精品国产精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 成人av一区二区三区在线看| 热99在线观看视频| www.色视频.com| av视频在线观看入口| 99riav亚洲国产免费| 国产69精品久久久久777片| 91精品国产九色| 亚洲av成人av| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲成人久久爱视频| 搞女人的毛片| 五月伊人婷婷丁香| 欧美日韩乱码在线| 性色avwww在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 一区福利在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 秋霞在线观看毛片| 午夜日韩欧美国产| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩高清综合在线| 内地一区二区视频在线| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美bdsm另类| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产免费男女视频| 九色成人免费人妻av| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一区二区三区免费毛片| 午夜日韩欧美国产| 天堂√8在线中文| 国产精品久久电影中文字幕| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日韩强制内射视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 免费av毛片视频| 久久99热6这里只有精品| 亚洲av二区三区四区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产高清三级在线| 国产高清激情床上av| 午夜激情欧美在线| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品久久国产高清桃花| 黄色一级大片看看| 亚洲av一区综合| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久伊人网av| 女人被狂操c到高潮| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精品国产av成人精品 | 美女cb高潮喷水在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产私拍福利视频在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线免费十八禁| 亚洲经典国产精华液单| 日本a在线网址| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 九九爱精品视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 能在线免费观看的黄片| 身体一侧抽搐| 一本久久中文字幕| 国语自产精品视频在线第100页| 99九九线精品视频在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 天堂动漫精品| 国产综合懂色| 久久久久久久久大av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 我的老师免费观看完整版| 天天躁日日操中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 成人漫画全彩无遮挡| 成人一区二区视频在线观看| 美女黄网站色视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 精华霜和精华液先用哪个| 免费在线观看成人毛片| 波多野结衣高清无吗| 好男人在线观看高清免费视频| 在线a可以看的网站| 岛国在线免费视频观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美日本视频| 亚洲最大成人av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99热网站在线观看| 又爽又黄a免费视频| 男女下面进入的视频免费午夜| a级毛色黄片| 国产高清视频在线播放一区| 国产真实乱freesex| av福利片在线观看| 国产av不卡久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 久久久久久久午夜电影| 中文字幕熟女人妻在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 草草在线视频免费看| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久久中文| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美成人免费av一区二区三区| 波多野结衣高清无吗| 老司机影院成人| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲最大成人av| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本黄色片子视频| 国产高清不卡午夜福利| 国产av不卡久久| 桃色一区二区三区在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 一级黄片播放器| 白带黄色成豆腐渣| 国产黄a三级三级三级人| 国产色爽女视频免费观看| 久久久成人免费电影| 高清毛片免费看| 亚洲欧美日韩高清专用| 身体一侧抽搐| 乱系列少妇在线播放| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 禁无遮挡网站| 亚洲成人久久性| 国产亚洲精品久久久com| 国产熟女欧美一区二区| 午夜精品在线福利| 国产高潮美女av| 久久久色成人| 久久热精品热| 麻豆乱淫一区二区| 精品人妻视频免费看| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99热6这里只有精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产欧美日韩一区二区精品| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品人妻熟女av久视频| 成人av一区二区三区在线看| 51国产日韩欧美| 97碰自拍视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产一区亚洲一区在线观看| 中文字幕久久专区| 长腿黑丝高跟| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成年女人永久免费观看视频| 国产亚洲精品av在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av专区在线播放| 久久久久久久午夜电影| 色5月婷婷丁香| 综合色丁香网| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品影视一区二区三区av| 精品福利观看| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品一区二区性色av| 亚洲国产色片| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产69精品久久久久777片| 国产一区二区三区av在线 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av一区综合| 国产成人freesex在线 | 22中文网久久字幕| 久久99热6这里只有精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品久久久久久成人av| 免费电影在线观看免费观看| 免费人成在线观看视频色| 变态另类丝袜制服| 国产亚洲精品av在线| 免费观看人在逋| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 六月丁香七月| 国产午夜福利久久久久久| 99在线视频只有这里精品首页| 精品人妻偷拍中文字幕| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美极品一区二区三区四区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产亚洲91精品色在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 嫩草影院精品99| 国产免费男女视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 黄色配什么色好看| 性色avwww在线观看| 不卡一级毛片| 最近的中文字幕免费完整| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲美女视频黄频| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲无线观看免费| 欧美zozozo另类| 黄色日韩在线| 99在线视频只有这里精品首页| 97碰自拍视频| 老司机福利观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲人成网站高清观看| 淫秽高清视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 中国美女看黄片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产美女午夜福利| 日本色播在线视频| 日韩欧美国产在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 一个人看视频在线观看www免费| 夜夜爽天天搞| 精品一区二区三区人妻视频| a级毛色黄片| 少妇丰满av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产成年人精品一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 99riav亚洲国产免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品成人久久久久久| 国产美女午夜福利| 成人毛片a级毛片在线播放| 热99re8久久精品国产| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩三级伦理在线观看| 人人妻人人看人人澡| 日本爱情动作片www.在线观看 | 最近的中文字幕免费完整| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 成人永久免费在线观看视频| 美女内射精品一级片tv| 两个人的视频大全免费| 成人二区视频| 在线免费观看的www视频| 成人精品一区二区免费| 69av精品久久久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 热99re8久久精品国产| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久久久久国产a免费观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲欧美清纯卡通| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲久久久久久中文字幕| 深夜精品福利| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成人二区视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产真实伦视频高清在线观看| 中出人妻视频一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 日日干狠狠操夜夜爽| 看片在线看免费视频| 国产男人的电影天堂91| 十八禁国产超污无遮挡网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产乱人偷精品视频| 热99在线观看视频| 亚洲人成网站在线播| 国产不卡一卡二| 国产v大片淫在线免费观看| 久久国产乱子免费精品| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 男人舔女人下体高潮全视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 3wmmmm亚洲av在线观看| 人妻久久中文字幕网| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产自在天天线| 老司机午夜福利在线观看视频| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 少妇丰满av| 亚洲不卡免费看| 色综合亚洲欧美另类图片| 丝袜喷水一区| 变态另类丝袜制服| 黄色一级大片看看| 成人性生交大片免费视频hd| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品国内亚洲2022精品成人| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产视频内射| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产av在哪里看| 久久久久久久久久久丰满| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美3d第一页| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲丝袜综合中文字幕| 综合色av麻豆| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲av第一区精品v没综合| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久午夜福利片| 永久网站在线| 国产真实乱freesex| 久久久午夜欧美精品| 女人被狂操c到高潮| 看非洲黑人一级黄片| 国产乱人偷精品视频| 精品午夜福利在线看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 嫩草影院精品99| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品无人区乱码1区二区| 精华霜和精华液先用哪个| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久久久午夜电影| 在线a可以看的网站| 国产精品一二三区在线看| 国产精品,欧美在线| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 色播亚洲综合网| 男女啪啪激烈高潮av片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩欧美免费精品| 国产精品一区二区性色av| 99热这里只有精品一区| 亚洲精品国产成人久久av| 国产熟女欧美一区二区| 久久草成人影院| 男女边吃奶边做爰视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲av五月六月丁香网| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品人妻久久久影院| 婷婷亚洲欧美| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 看十八女毛片水多多多| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品午夜福利在线看| 看十八女毛片水多多多| 国产视频内射| 国产欧美日韩精品亚洲av| 婷婷精品国产亚洲av| 国产亚洲欧美98| 国产高清视频在线观看网站| 三级经典国产精品| 日本黄色片子视频| 哪里可以看免费的av片| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美3d第一页| 色哟哟·www| 在线a可以看的网站| 老司机午夜福利在线观看视频| 97在线视频观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 身体一侧抽搐| 久久久久久久久久久丰满|