miRNA在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證中的表達(dá)譜特征及生物信息學(xué)分析

謝麗華 陳娟 謝冰穎 許惠娟 陳賽楠 葉云金 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點(diǎn)研究室，福建 福州 350003

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是常見(jiàn)的老年性疾病，發(fā)病率高。中醫(yī)藥能顯著改善骨質(zhì)疏松癥癥狀、防治并發(fā)癥、提高生存質(zhì)量和延長(zhǎng)壽命等。但是中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)其基本理論及原理的闡述，對(duì)現(xiàn)代疾病生物學(xué)本質(zhì)的探索不足，如能在生物學(xué)層面運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)中醫(yī)證候的實(shí)質(zhì)進(jìn)行深入的闡述，這將更有利于中西醫(yī)的溝通與結(jié)合。表觀遺傳學(xué)是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，它能很好地闡述“遺傳-環(huán)境-疾病”相互作用機(jī)制和關(guān)系，而這種“環(huán)境疾病”模式與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中“天人合一”的整體觀相符。所以將表觀遺傳學(xué)的概念及相關(guān)技術(shù)引入到中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究會(huì)有所突破，并有新發(fā)現(xiàn)的可能。

miRNA作為表觀遺傳學(xué)主要研究的內(nèi)容之一，主要作用環(huán)節(jié)在基因轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控。miRNA是一類(lèi)存在于真核生物體內(nèi)，長(zhǎng)22～25 bp的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)與靶基因的特異性堿基配對(duì)引起靶序列降解或翻譯阻遏，從而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[1-3]。研究表明miRNA參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程[4]。課題組前期已經(jīng)多次應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)開(kāi)展證候-基因組研究，發(fā)現(xiàn)腎陰虛證主要集中于代謝、免疫功能類(lèi)基因的表達(dá)異常[5-7]。在此系列研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇為基因調(diào)控環(huán)節(jié)的miRNA，計(jì)劃在沿用病癥結(jié)合的研究思路基礎(chǔ)上，采用miRNA芯片，觀察PMOP腎陰虛證的miRNA表達(dá)變化情況，旨在為闡明PMOP腎陰虛證的本質(zhì)及為治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用病例對(duì)照研究方法，選擇絕經(jīng)后2年以上、75歲以下的受試者，對(duì)受試者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，檢測(cè)肝腎功能、血尿常規(guī)、心電圖和B超等。雙能X線(xiàn)骨密度儀檢測(cè)正位腰椎L1～4和左側(cè)股骨上端骨密度，中醫(yī)辨證，分組如下：PMOP腎陰虛組3例，PMOP腎陽(yáng)虛組3例，健康絕經(jīng)后婦女3名作為對(duì)照組。本研究方案獲得福建省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)藥臨床研究倫理委員會(huì)審批通過(guò)。(1)診斷標(biāo)準(zhǔn)：骨質(zhì)疏松癥診斷參照《中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)》(第2稿)[8]，中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》[9]。(2)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；符合中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；年齡在46～75歲，自然絕經(jīng)2年以上的漢族婦女；受試者知情同意。(3)排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合骨質(zhì)疏松癥診斷及中醫(yī)腎陰虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)者；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥者；合并有心腦血管?chē)?yán)重疾病者；肝、腎功能檢查異常者；最近一個(gè)月用過(guò)中藥治療骨質(zhì)疏松癥者，或近3個(gè)月內(nèi)用激素替代治療、使用降鈣素者，或近6個(gè)月內(nèi)有連續(xù)15 d用雙膦酸鹽等防治骨質(zhì)疏松癥者。

1.2 用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)miRNA表達(dá)譜及篩選差異表達(dá)基因

1.2.1樣品RNA提取和質(zhì)檢：取外周血5 mL，淋巴細(xì)胞分離液提取靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞，使用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，Nanodrop測(cè)定RNA 260/280的吸光度及濃度，用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。

1.2.2芯片雜交及掃描：基因芯片使用Agilent miRNA芯片，委托北京博奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。對(duì)Total RNA進(jìn)行純化，純化后重新定量。Total RNA 的去磷酸化、標(biāo)記、雜交，在洗液中清洗甩干后，使用 Agilent 芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，得到雜交圖片。

1.2.3圖像采集和數(shù)據(jù)分析：使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對(duì)雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)，然后使用Agilent Gene Spring軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析?；跀?shù)據(jù)庫(kù)KEGG查詢(xún)差異涉及miRNA的信號(hào)通路，及相關(guān)靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析序列以及預(yù)測(cè)靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者數(shù)量分析

納入對(duì)象9人均進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)中途退出者。

2.2 PMOP腎陰虛證組與其他2組miRNA表達(dá)譜的差異性分析

PMOP腎陰虛證組與對(duì)照組相比，篩選差異表達(dá)miRNA49條；PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽(yáng)虛證組相比，篩選差異表達(dá)miRNA71條；PMOP腎陰虛證組分別與其他2組比較，有20條共同的差異表達(dá)miRNA，與正常對(duì)照組相比，其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有17條，表達(dá)下調(diào)的miRNA有3條(見(jiàn)表1)。

表1 PMOP腎陰虛證組與其他2組比較共同差異表達(dá)miRNATable 1 Differential expression of miRNA in Kidney Yin deficiency group compared with the other two groups

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

根據(jù)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)的結(jié)果，隨機(jī)選取3個(gè)表達(dá)變化顯著的miRNA (hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR再次驗(yàn)證，內(nèi)參選擇snRNAU6。結(jié)果顯示(圖1)，與對(duì)照組相比，PMOP腎陰虛組hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p表達(dá)水平明顯升高(FC=3.56、4.20)，hsa-miR-95-3p表達(dá)明顯下調(diào)(FC=2.10)，3條miRNA在芯片樣本中得到較好的驗(yàn)證，qPCR的結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致。

圖1 定量PCR驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果Fig.1 Confirmation of microarray results using quantitative PCR

2.4 差異表達(dá)miRNA的pathway分析

將差異表達(dá)的miRNA用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行pathway分析，選取前30個(gè)顯著富集的kegg通路，根據(jù)P值繪制成柱狀圖(圖2)，主要包括代謝通路、癌癥通路、Rap1信號(hào)通路、粘著斑信號(hào)通路、PI3K-Akt、MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路。

2.5 差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

為了更全面地了解PMOP腎陰虛證相關(guān)miRNA的功能，同時(shí)采用miRWalk、Microt4、miRanda、miRdb、miRMap、PicTar2、PITA、RNA22、Targetscan、RNAhybrid 10個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)逐一預(yù)測(cè)這20個(gè)miRNA的靶基因，進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)分析，最終結(jié)果取6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果的重疊部分，為了進(jìn)一步縮小靶基因預(yù)測(cè)范圍，從結(jié)果中挑選出同時(shí)被5個(gè)miRNA同時(shí)作用的靶基因，共9個(gè)(見(jiàn)表2)。

3 討論

隨著對(duì)miRNA功能研究的深入，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起多種作用。許多miRNA被證明在骨代謝中都起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，參與維持骨代謝的平衡。例如miR-133 a和miR-204通過(guò)抑制成骨分化中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，抑制成骨細(xì)胞分化[10-11]；有些miRNA在骨重建過(guò)程中有雙重作用，如miR-214既能促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，同時(shí)也能抑制骨形成[12-13]。對(duì)這些miRNA的深入研究可以為骨代謝的疾病診斷與治療提供新的思路與方法。本研究以miRNA芯片技術(shù)為研究手段，通過(guò)探討PMOP腎陰虛證組與PMOP腎陽(yáng)虛證組和健康絕經(jīng)后婦女3組miRNA基因差異的表達(dá)情況，揭示與PMOP腎陰虛證相關(guān)的miRNA表達(dá)譜特征，旨在整體miRNA表達(dá)水平闡明POP腎陰虛證的本質(zhì)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎陰虛證組與對(duì)照組、腎陽(yáng)虛證組的差異表達(dá)miRNA分別為49條、71條；腎陰虛證組與其他兩組比較，篩選出20條共同差異表達(dá)miRNA，和對(duì)照組相比，其中表達(dá)上調(diào)的有17條，表達(dá)下調(diào)的有3條。隨后挑選hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p這3條miRNAs進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，證實(shí)qPCR的表達(dá)數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致。

圖2 顯著富集的kegg信號(hào)通路Fig.2 Significantly enriched kegg pathway

表2 差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)Table 2 Target gene prediction results of differential expression of miRNA

miRNA是機(jī)體中一個(gè)龐大復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系，對(duì)miRNA相關(guān)信號(hào)通路的研究是了解其調(diào)控機(jī)理的重要方式。筆者對(duì)這些差異miRNA進(jìn)行根據(jù)pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些miRNA主要參與代謝通路、癌癥通路、Rap1信號(hào)通路、粘著斑信號(hào)通路、PI3K-Akt、MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路的調(diào)控等。研究證實(shí)，這些信號(hào)通路的多條通路都參與了骨代謝的調(diào)控。PI3K-Akt信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中，能調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[14-15]，Akt及其下游的靶基因是骨形成的關(guān)鍵調(diào)控者。Wu等[16]研究證實(shí)四物湯的提取物可以通過(guò)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)骨形成進(jìn)而防止骨質(zhì)疏松。MAPK 信號(hào)通路主要包括 ERK1/2通路、JNK 通路、P38 通路和 ERK5通路。Kim等[17]的研究結(jié)果表明膠原蛋白水解物可以通過(guò)ERK/MAPK通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖； Hah等[18]實(shí)驗(yàn)說(shuō)明JNK 通路在成骨細(xì)胞分化和生存中具有重要作用；Choi等[19]和Rodríguez-Carballo等[20]報(bào)道了P38通路可以通過(guò)促進(jìn)骨形成和抑制破骨細(xì)胞分化改善骨質(zhì)疏松。Wnt信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的分化和骨形成具有重要的促進(jìn)作用，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)Runx2等成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[21]。此過(guò)程對(duì)于骨形成非常重要，當(dāng)該通路紊亂時(shí)會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。由于Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞中扮演著重要角色，已成為藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)，并被成功地應(yīng)用于臨床。如Romosozumab藥物已經(jīng)完成臨床II期研究階段，目前正在進(jìn)行III期臨床項(xiàng)目。Romosozumab是一種全人源化單克隆抗體，通過(guò)抑制骨硬化蛋白活性，激活Wnt通路而促進(jìn)骨形成，從而促進(jìn)成骨作用[22-23]?？傊琴|(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種相關(guān)信號(hào)通路之間存在交互和交叉的作用，具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

miRNA功能研究的重點(diǎn)在于對(duì)其靶基因調(diào)控的研究。miRNA通過(guò)精確地調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)合生物信息學(xué)的方法，2009年Friedman等[24]預(yù)測(cè)，miRNA作用的靶基因數(shù)量超過(guò)45 000個(gè)，調(diào)控了人類(lèi)2/3以上的蛋白質(zhì)編碼基因。一個(gè)miRNA可以有不同的靶基因，一個(gè)靶基因也可以由多個(gè)miRNA調(diào)控。通常認(rèn)為，受多個(gè)miRNA同時(shí)作用靶基因更有可能發(fā)揮重要作用[25]。筆者最終篩選出9個(gè)miRNA的靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148)，其中SOX11、PHF20基因被認(rèn)為與骨的生長(zhǎng)、發(fā)育相關(guān)。SOX11基因在許多干細(xì)胞中都有表達(dá)，包括骨祖細(xì)胞，在細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，SOX11基因?qū)τ诩?xì)胞的存活和分化起了重要作用，并能通過(guò)誘導(dǎo)生長(zhǎng)板的形成促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)[26]。SOX11基因過(guò)表達(dá)可以顯著促進(jìn)老鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[27]，機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化[28]。大鼠全身性敲低PHF20基因會(huì)表現(xiàn)出腰椎發(fā)育異常[29]，研究其發(fā)病的具體機(jī)制，Yang等[30]通過(guò)過(guò)表達(dá)PHF20基因，發(fā)現(xiàn)它可以增加ALP活性和骨礦化形成，及骨形成標(biāo)志物Runx2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。相反，抑制PHF20表達(dá)會(huì)降低骨形成及骨礦化作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用miRNA芯片技術(shù)研究PMOP腎陰虛證中差異表達(dá)miRNA，并對(duì)這些miRNA進(jìn)行pathway分析及靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，這些差異表達(dá)miRNA可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、Wnt信號(hào)通路等與骨代謝相關(guān)信號(hào)通路參與PMOP腎陰虛證的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。這只是對(duì)PMOP腎陰虛證miRNA基因表達(dá)譜的初步探討，今后需要擴(kuò)大樣本驗(yàn)證miRNA，及進(jìn)一步探討miRNA與靶基因的關(guān)系，并對(duì)miRNA進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)功能驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)差異miRNA及其調(diào)控的靶基因深入研究，將有助于理解PMOP腎陰虛證的本質(zhì)及為治療提供新的思路與方法。