謝平金 史桐雨 梁桂洪 柴生颋,3* 曹學(xué)偉 孫赫1,,
1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實驗室,廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510240 4. 廣東省中醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510240
膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是以膝關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病[1],隨年齡增長而發(fā)生率明顯增加,是引起老年人關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的主要原因,且往往病程日久,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著老齡化社會的到來,KOA的發(fā)病率目前正快速增長,故對于如何早期防治KOA已成為當(dāng)前研究的熱點。川芎嗪作為活血化瘀類中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿,在治療KOA的臨床及實驗研究中已有相關(guān)報道。本研究通過觀察川芎嗪對實驗性大鼠KOA關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評分、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達水平的影響來探討其防治早期KOA的機制,為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供有效途徑和應(yīng)用依據(jù)。
1.1.1動物與分組:健康雄性大鼠35只,體重180~220 g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。
1.1.2主要試劑:磷酸川芎嗪片(麗珠集團利民制藥廠,國藥準(zhǔn)字:H44024348);塞來昔布(輝瑞制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字J20140072);木瓜蛋白酶(上海源葉科技有限公司S10011,CAS:9001-73-4);石蠟(國藥化學(xué)試劑有限公司);蘇木素伊紅染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司);中強度RIPA裂解液(FD008,弗德生物);蛋白酶抑制劑混合物(FD1001,弗德生物);100 mmol/LPMSF(FD100,弗德生物)蛋白磷酸酶抑制劑混合物(FD1002,弗德生物);BCA蛋白定量試劑盒(FD2001,弗德生物);蛋白上樣緩沖液(5×)(AR1112,博士德);預(yù)染蛋白Marker(Fermentas);Tris-base(V900483,Vetec);甘氨酸(G800880,Macklin);過硫酸銨(A801035,Macklin);SDS(Biosharp);丙烯酰胺(0341-1 kg,Amresco);N.N-甲叉雙丙烯酰胺(N813086-100 g,Macklin);PVDF膜0.45 μm(Millipore);PVDF膜0.22 μm(Millipore);脫脂奶粉(232100,BD);TWEEN 20(Biosharp);顯影定影試劑(國產(chǎn))TRIzol Reagent(DP424,天根);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI-2220,DBI);熒光定量PCR檢測試劑盒(AOPR-1200,Genecopies);DEPC(V900882,Vetec);無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷(國產(chǎn))。
1.1.3主要設(shè)備:臺式高速離心機(SCIlogex);純水儀(重慶艾科浦);熒光定量PCR儀(7500,ABI);微量核酸定量儀(SMA4000,Merinton);多功能酶標(biāo)儀(上?,F(xiàn)科儀器有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);臺式高速離心機(SCIlogex);磁力攪拌器(常州澳華儀器有限公司);脫色搖床(北京六一儀器廠);電泳儀(北京六一儀器廠);水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司);暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司);感光膠片(kodak);封口機PF(溫州市江南機械廠);低溫冰箱(西門子);掃描儀(Canon);灰度分析軟件(Image J);多功能酶標(biāo)儀(上?,F(xiàn)科儀器有限公司)。輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(德國Leica)。
1.1.4溶液配制:轉(zhuǎn)移緩沖液(2 L):甘氨酸28.8 g,Tris 4.84 g,甲醇400 mL,加去離子水定溶至2000 mL;電泳緩沖液(2 L):Tris 6.06 g,甘氨酸37.54 g,SDS 2 g,加去離子水定溶至2000 mL;TBS緩沖液(1 L):1 mmol/LTris-HCl(pH=7.5),10 mL NaCl 8.8 g,加去離子水定溶至1000 mL;30%丙烯酰胺(1 L):丙烯酰胺290 g,BIS 10 g,加去離子水充分溶解后定溶至1 000 mL;非磷酸化蛋白酶抑制劑:每1 mL RIPA試劑中加入5 μL蛋白酶抑制劑和10 μL 100 mmol/L的PMSF,混勻;磷酸化蛋白酶抑制劑:每1 mL RIPA試劑中同時加入5 μL蛋白酶抑制劑、10 μL 100 mmol/L的PMSF、5 μL磷酸化蛋白酶抑制劑,混勻。
1.2.1分組與造模:將實驗動物依據(jù)隨機分配的原則分為正常組、模型對照組、高劑量組、低劑量組和陽性對照組。每組7只,除正常組外,均采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射建立KOA大鼠模型。用0.9%氯化鈉溶液配4%(W/V)木瓜蛋白酶溶液。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,麻醉成功后雙膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、屈曲約 45°,從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)的膝眼向髁間窩方向進針,明顯有落空感后,針尖抵達股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤2 mm,并注射木瓜蛋白酶,分別向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注入4%木瓜蛋白酶0.2 mL。每隔3 d注射1次,連續(xù)注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1 w,觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)外觀,并在各組各取1只大鼠處死后,取關(guān)節(jié)軟骨行HE切片,驗證造模是否成功。
1.2.2干預(yù)方法:驗證造模成功后,根據(jù)磷酸川芎嗪片以及塞來昔布臨床上人服用的常規(guī)劑量,與大鼠間藥物劑量的換算方法進行換算,開始灌胃給藥治療,高劑量組、低劑量組分別給予灌胃磷酸川芎嗪片100 mg/kg和50 mg/kg,每天用藥1次;陽性對照組灌服塞來昔布劑量為24 mg/kg,每日定時給藥1次,正常組、模型組灌服等量的生理鹽水,每天1次,連續(xù)灌胃 6 w后處死,右膝脛骨平臺行組織切片觀察,左膝取軟骨組織進行Western Blot蛋白檢測、qRT-PCR-檢測。所有SD大鼠均按常規(guī)進食飼養(yǎng)者提供的大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水。
1.2.3檢測指標(biāo):(1)HE切片染色觀察。治療結(jié)束后,處死各組實驗鼠,右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨平臺經(jīng)4%多聚甲醛4 ℃固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋,制作成石蠟標(biāo)本,行4~6 μm 厚切片。HE染色后在光鏡下觀察各組切片染色情況,采用改良Mankin’s法[2]對軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、染色以及潮線的完整性評分,評分越高說明軟骨退變越嚴(yán)重。(2)Western Blot檢測。取-80 ℃保存?zhèn)溆闷滠浌墙M織,并根據(jù)說明書配制全蛋白提取液,將軟骨組織置于全蛋白提取液中,利用勻漿器于冰上破碎軟骨組織。勻漿后,采用Braford 比色法測定樣品蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1),100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別置于濃縮膠和分離膠中電泳,350 mA轉(zhuǎn)膜70 min。37 ℃封閉液中封閉1 h;將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的BMP2抗體(稀釋比例1∶1000,轉(zhuǎn)膜條件:300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min,廠家:abcam,貨號:Ab14933)、Smad1抗體(稀釋比例1∶1000,轉(zhuǎn)膜條件:300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min,廠家:abcam,貨號:Ab131371),25 mL TBST洗滌PVDF膜3次,每次5 min;將PVDF膜放入含有3 mL辣根過氧化物酶標(biāo)記的稀釋二抗溶液的小槽內(nèi),置于搖床上室溫平緩搖動40 min[二抗:HRP Goat anti-Rabbit IgG(廠家:BOSTER,貨號:BA1054,稀釋比例:1∶20000,孵育條件:室溫孵育40 min],25 mL TBST洗滌PVDF膜3次,每次7 min;用化學(xué)發(fā)光顯色后進行圖像分析,經(jīng)軟件分析,以BMP2/β-actin、Smad1/β-actin比值表示BMP2、Smad1蛋白表達水平。(3)qRT-PCR-檢測 BMP2 mRNA、Smad1 mRNA表達。采用Trizol 法常規(guī)提取關(guān)節(jié)軟骨總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 第一鏈,然后行qRT-PCR進行40個循環(huán)擴增,同時追加溶解曲線反應(yīng)檢測引物特異性。引物序列如下:BMP2上游引物:5′-CAGTGGGAGAGCTTTGATGT-3′,下游引物:5′-ACCTGGCTTCTCCTCTAAGT-3′;SMAD1上游引物:5′-GGGACTGCCTCATGTCATTTA-3′,下游引物:5′-AGACTTCCTTCTGCTTGGAAC-3′;GAPDH(內(nèi)參)上游引物:5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′,下游引物:5′-GGATGGAATTGTGAGGGAG ATG-3′。
實驗結(jié)束后,各組行HE切片染色后,除空白組外,各組均出現(xiàn)不同程度的軟骨損傷,如表1示,各組軟骨Mankin評分中,川芎嗪各劑量組和陽性對照組均較空白組高(P<0.05),均較模型組低(P<0.05),且川芎嗪高劑量組<陽性對照組<川芎嗪低劑量組(P<0.05)。
表1 各組軟骨組織Mankin評分
注:與空白組對比,*P<0.05;與模型組對比,▲P<0.05;與陽性對照組對比,#P<0.05。
正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨BMP-2及Smad1蛋白相對表達量較模型組均高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與陽性對照組相比,川芎嗪高劑量組BMP-2及Smad1表達量明顯高于陽性對照組(P<0.05),而川芎嗪低劑量組BMP-2及Smad1表達量則低于陽性對照組。見圖1、2。
圖1 各組軟骨BMP-2、Smad1蛋白相對表達量(與模型組對比,*P<0.05;與陽性對照組對比,△P<0.05)Fig.1 The relative expression of BMP-2 and Smad1 protein in cartilage of each group(Comparison with model group,*P<0.05;Comparison with positive control group,△P<0.05).
圖2 各組軟骨BMP-2、Smad1表達凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of BMP-2 and Smad1 expression in cartilage of each group
正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中,軟骨BMP-2mRNA、Smad1mRNA相對表達量較模型組均高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與陽性對照組相比,川芎嗪高劑量組BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達量明顯高于陽性對照組(P<0.05),而川芎嗪低劑量組其表達則均低于陽性對照組。見圖3。
圖3 各組軟骨BMP-2 mRNA及Smad1-mRNA相對表達量(與模型組對比,*P<0.05;與陽性對照組對比,△P<0.05)Fig.3 The relative expression of BMP-2 mRNA and smad1-mRNA in cartilage of each group(Comparison with model group,*P<0.05;Comparison with positive control group,△P<0.05).
膝骨關(guān)節(jié)炎是以膝關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病[1]。KOA臨床上癥狀多表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)局部疼痛、晨僵、腫脹、活動受限,嚴(yán)重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)的畸形,并最終可導(dǎo)致殘疾的風(fēng)險[3]。本病主要見于中老年患者,且往往病程日久,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,且隨著老齡化社會的到來,KOA的發(fā)病率目前正以驚人的速度增長,對于如何防治KOA已成為當(dāng)前的研究熱點,因此,對于KOA的早期干預(yù)研究,就顯得非常必要。中醫(yī)認(rèn)為KOA屬于“膝痹病”“骨痹”“痹證”等范疇,并以肝腎虧虛為本、瘀血阻滯為標(biāo),而發(fā)病早期以瘀血阻滯為關(guān)鍵病機。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論,結(jié)合臨床體會,筆者認(rèn)為治療上早期活血化瘀是防治KOA發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。川芎嗪(四甲基毗嗪,ligustrazine)是從活血化瘀類中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿,具有改善關(guān)節(jié)內(nèi)微循環(huán),降低骨內(nèi)壓作用[4]。近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),川芎嗪能促進軟骨細(xì)胞的增殖,同時抑制軟骨細(xì)胞的凋亡[5];本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)川芎嗪能明顯降低骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的含量水平,對減輕OA炎癥有一定的作用[6]。本研究通過觀察川芎嗪對實驗性大鼠KOA關(guān)節(jié)軟骨組織病理以及BMP-2、Smad1表達水平的影響來探討其防治OA的機制,為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供有效途徑和應(yīng)用依據(jù)。木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射作為誘導(dǎo)大鼠膝早期骨關(guān)節(jié)炎的方法,已廣泛用于研究[7-8]。本實驗采用木瓜蛋白酶溶液關(guān)節(jié)腔注射制作大鼠KOA模型,并干預(yù)6 w后行HE染色切片軟骨Mankin評分,Mankin評分越高,說明軟骨損傷程度越嚴(yán)重。其中川芎嗪各劑量組和陽性對照組均較空白組高(P<0.05),均較模型組低(P<0.05),且川芎嗪高劑量組<陽性對照組<川芎嗪低劑量組(P<0.05)。這充分說明川芎嗪能減輕關(guān)節(jié)軟骨退變且適當(dāng)提高血藥濃度,能更好地減輕關(guān)節(jié)軟骨退變程度。
BMP-2作為BMPs 30種蛋白中的一員,已被證明有刺激蛋白多糖的合成,誘導(dǎo)蛋白聚糖和II型膠原的表達,促進軟骨內(nèi)成骨的能力,并具有對軟骨細(xì)胞代謝合成代謝的影響[9]。已有研究表明[10],BMP-2可以提高骨軟骨損傷后軟骨的修復(fù)過程,減少纖維軟骨的形成,從而改善軟骨基質(zhì)的外觀和構(gòu)成。長期遞送 BMP-2相比較于自體軟骨細(xì)胞移植,前者可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的透明軟骨[11]。Smad1作為BMP-Smad信號通路的關(guān)鍵分子,其活化是被嚴(yán)格并精確調(diào)控的,特別是被大量的負(fù)性調(diào)控因子所調(diào)節(jié),它的負(fù)性調(diào)節(jié)對正常的生理功能發(fā)揮有重要的作用[12-13],Smad1蛋白的表達可能與BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的軟骨內(nèi)化骨分子機制間存在相關(guān)性[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA相對表達量較模型組均高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與陽性對照組相比,川芎嗪高劑量組BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達量明顯高于陽性對照組(P<0.05),而川芎嗪低劑量組其表達則均低于陽性對照組。這表明適當(dāng)提高川芎嗪血藥濃度,可能通過上調(diào)BMP-2mRNA及Smad1mRNA基因的表達,從而促進BMP-2及Smad1蛋白的表達,這可能是在某種程度上減輕關(guān)節(jié)軟骨退變、修復(fù)軟骨損傷作用的機制之一。但BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達上調(diào)后能否進一步激活軟骨細(xì)胞特異性的下游靶基因、實現(xiàn)的具體途徑如何,還有待進一步的研究。下一階段將重點研究川芎嗪含藥血清調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的分子機制,為川芎嗪在防治OA方面提供新的科學(xué)依據(jù)和實驗方法。