川芎嗪對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達的影響

謝平金 史桐雨 梁桂洪 柴生颋,3* 曹學偉 孫赫1,,

1. 廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心中醫(yī)骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405 3. 廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240 4. 廣東省中醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是以膝關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病[1]，隨年齡增長而發(fā)生率明顯增加，是引起老年人關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的主要原因，且往往病程日久，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。隨著老齡化社會的到來，KOA的發(fā)病率目前正快速增長，故對于如何早期防治KOA已成為當前研究的熱點。川芎嗪作為活血化瘀類中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿，在治療KOA的臨床及實驗研究中已有相關(guān)報道。本研究通過觀察川芎嗪對實驗性大鼠KOA關(guān)節(jié)軟骨組織學評分、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達水平的影響來探討其防治早期KOA的機制，為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供有效途徑和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與分組：健康雄性大鼠35只，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑：磷酸川芎嗪片(麗珠集團利民制藥廠，國藥準字：H44024348)；塞來昔布(輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20140072)；木瓜蛋白酶(上海源葉科技有限公司S10011，CAS：9001-73-4)；石蠟(國藥化學試劑有限公司)；蘇木素伊紅染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；中強度RIPA裂解液(FD008，弗德生物)；蛋白酶抑制劑混合物(FD1001，弗德生物)；100 mmol/LPMSF(FD100，弗德生物)蛋白磷酸酶抑制劑混合物(FD1002，弗德生物)；BCA蛋白定量試劑盒(FD2001，弗德生物)；蛋白上樣緩沖液(5×)(AR1112，博士德)；預染蛋白Marker(Fermentas)；Tris-base(V900483，Vetec)；甘氨酸(G800880，Macklin)；過硫酸銨(A801035，Macklin)；SDS(Biosharp)；丙烯酰胺(0341-1 kg，Amresco)；N.N-甲叉雙丙烯酰胺(N813086-100 g，Macklin)；PVDF膜0.45 μm(Millipore)；PVDF膜0.22 μm(Millipore)；脫脂奶粉(232100，BD)；TWEEN 20(Biosharp)；顯影定影試劑(國產(chǎn))TRIzol Reagent(DP424，天根)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI-2220，DBI)；熒光定量PCR檢測試劑盒(AOPR-1200，Genecopies)；DEPC(V900882，Vetec)；無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷(國產(chǎn))。

1.1.3主要設(shè)備：臺式高速離心機(SCIlogex)；純水儀(重慶艾科浦)；熒光定量PCR儀(7500，ABI)；微量核酸定量儀(SMA4000，Merinton)；多功能酶標儀(上?，F(xiàn)科儀器有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；臺式高速離心機(SCIlogex)；磁力攪拌器(常州澳華儀器有限公司)；脫色搖床(北京六一儀器廠)；電泳儀(北京六一儀器廠)；水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司)；暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司)；感光膠片(kodak)；封口機PF(溫州市江南機械廠)；低溫冰箱(西門子)；掃描儀(Canon)；灰度分析軟件(Image J)；多功能酶標儀(上海現(xiàn)科儀器有限公司)。輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(德國Leica)。

1.1.4溶液配制：轉(zhuǎn)移緩沖液(2 L)：甘氨酸28.8 g，Tris 4.84 g，甲醇400 mL，加去離子水定溶至2000 mL；電泳緩沖液(2 L)：Tris 6.06 g，甘氨酸37.54 g，SDS 2 g，加去離子水定溶至2000 mL；TBS緩沖液(1 L)：1 mmol/LTris-HCl(pH=7.5)，10 mL NaCl 8.8 g，加去離子水定溶至1000 mL；30%丙烯酰胺(1 L)：丙烯酰胺290 g，BIS 10 g，加去離子水充分溶解后定溶至1 000 mL；非磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA試劑中加入5 μL蛋白酶抑制劑和10 μL 100 mmol/L的PMSF，混勻；磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA試劑中同時加入5 μL蛋白酶抑制劑、10 μL 100 mmol/L的PMSF、5 μL磷酸化蛋白酶抑制劑，混勻。

1.2 方法

1.2.1分組與造模：將實驗動物依據(jù)隨機分配的原則分為正常組、模型對照組、高劑量組、低劑量組和陽性對照組。每組7只，除正常組外，均采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射建立KOA大鼠模型。用0.9%氯化鈉溶液配4%(W/V)木瓜蛋白酶溶液。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后雙膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、屈曲約 45°，從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)的膝眼向髁間窩方向進針，明顯有落空感后，針尖抵達股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤2 mm，并注射木瓜蛋白酶，分別向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注入4%木瓜蛋白酶0.2 mL。每隔3 d注射1次，連續(xù)注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1 w，觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)外觀，并在各組各取1只大鼠處死后，取關(guān)節(jié)軟骨行HE切片，驗證造模是否成功。

1.2.2干預方法：驗證造模成功后，根據(jù)磷酸川芎嗪片以及塞來昔布臨床上人服用的常規(guī)劑量，與大鼠間藥物劑量的換算方法進行換算，開始灌胃給藥治療，高劑量組、低劑量組分別給予灌胃磷酸川芎嗪片100 mg/kg和50 mg/kg，每天用藥1次；陽性對照組灌服塞來昔布劑量為24 mg/kg，每日定時給藥1次，正常組、模型組灌服等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃 6 w后處死，右膝脛骨平臺行組織切片觀察，左膝取軟骨組織進行Western Blot蛋白檢測、qRT-PCR-檢測。所有SD大鼠均按常規(guī)進食飼養(yǎng)者提供的大鼠標準飼料和自來水。

1.2.3檢測指標：(1)HE切片染色觀察。治療結(jié)束后，處死各組實驗鼠，右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨平臺經(jīng)4%多聚甲醛4 ℃固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成石蠟標本，行4～6 μm 厚切片。HE染色后在光鏡下觀察各組切片染色情況，采用改良Mankin’s法[2]對軟骨組織結(jié)構(gòu)、細胞、染色以及潮線的完整性評分，評分越高說明軟骨退變越嚴重。(2)Western Blot檢測。取-80 ℃保存?zhèn)溆闷滠浌墙M織，并根據(jù)說明書配制全蛋白提取液，將軟骨組織置于全蛋白提取液中，利用勻漿器于冰上破碎軟骨組織。勻漿后，采用Braford 比色法測定樣品蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1)，100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e置于濃縮膠和分離膠中電泳，350 mA轉(zhuǎn)膜70 min。37 ℃封閉液中封閉1 h；將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的BMP2抗體(稀釋比例1∶1000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min，廠家：abcam，貨號：Ab14933)、Smad1抗體(稀釋比例1∶1000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min，廠家：abcam，貨號：Ab131371)，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min；將PVDF膜放入含有3 mL辣根過氧化物酶標記的稀釋二抗溶液的小槽內(nèi)，置于搖床上室溫平緩搖動40 min[二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG(廠家：BOSTER，貨號：BA1054，稀釋比例：1∶20000，孵育條件：室溫孵育40 min]，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次7 min；用化學發(fā)光顯色后進行圖像分析，經(jīng)軟件分析，以BMP2/β-actin、Smad1/β-actin比值表示BMP2、Smad1蛋白表達水平。(3)qRT-PCR-檢測 BMP2 mRNA、Smad1 mRNA表達。采用Trizol 法常規(guī)提取關(guān)節(jié)軟骨總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 第一鏈，然后行qRT-PCR進行40個循環(huán)擴增，同時追加溶解曲線反應(yīng)檢測引物特異性。引物序列如下：BMP2上游引物：5′-CAGTGGGAGAGCTTTGATGT-3′，下游引物：5′-ACCTGGCTTCTCCTCTAAGT-3′；SMAD1上游引物：5′-GGGACTGCCTCATGTCATTTA-3′，下游引物：5′-AGACTTCCTTCTGCTTGGAAC-3′；GAPDH(內(nèi)參)上游引物：5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′，下游引物：5′-GGATGGAATTGTGAGGGAG ATG-3′。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織學Mankin評分

實驗結(jié)束后，各組行HE切片染色后，除空白組外，各組均出現(xiàn)不同程度的軟骨損傷，如表1示，各組軟骨Mankin評分中，川芎嗪各劑量組和陽性對照組均較空白組高(P<0.05)，均較模型組低(P<0.05)，且川芎嗪高劑量組<陽性對照組<川芎嗪低劑量組(P<0.05)。

表1 各組軟骨組織Mankin評分

注：與空白組對比，*P<0.05；與模型組對比，▲P<0.05；與陽性對照組對比，#P<0.05。

2.2 Western Blot檢測軟骨組織BMP-2、Smad1蛋白表達結(jié)果

正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨BMP-2及Smad1蛋白相對表達量較模型組均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，川芎嗪高劑量組BMP-2及Smad1表達量明顯高于陽性對照組(P<0.05)，而川芎嗪低劑量組BMP-2及Smad1表達量則低于陽性對照組。見圖1、2。

圖1 各組軟骨BMP-2、Smad1蛋白相對表達量(與模型組對比，*P<0.05；與陽性對照組對比，△P<0.05)Fig.1 The relative expression of BMP-2 and Smad1 protein in cartilage of each group(Comparison with model group，*P<0.05；Comparison with positive control group，△P<0.05).

圖2 各組軟骨BMP-2、Smad1表達凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of BMP-2 and Smad1 expression in cartilage of each group

2.3 各組軟骨BMP-2mRNA及Smad1-mRNA相對表達量

正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中，軟骨BMP-2mRNA、Smad1mRNA相對表達量較模型組均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，川芎嗪高劑量組BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達量明顯高于陽性對照組(P<0.05)，而川芎嗪低劑量組其表達則均低于陽性對照組。見圖3。

圖3 各組軟骨BMP-2 mRNA及Smad1-mRNA相對表達量(與模型組對比，*P<0.05；與陽性對照組對比，△P<0.05)Fig.3 The relative expression of BMP-2 mRNA and smad1-mRNA in cartilage of each group(Comparison with model group，*P<0.05；Comparison with positive control group，△P<0.05).

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是以膝關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病[1]。KOA臨床上癥狀多表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)局部疼痛、晨僵、腫脹、活動受限，嚴重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)的畸形，并最終可導致殘疾的風險[3]。本病主要見于中老年患者，且往往病程日久，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，且隨著老齡化社會的到來，KOA的發(fā)病率目前正以驚人的速度增長，對于如何防治KOA已成為當前的研究熱點，因此，對于KOA的早期干預研究，就顯得非常必要。中醫(yī)認為KOA屬于“膝痹病”“骨痹”“痹證”等范疇，并以肝腎虧虛為本、瘀血阻滯為標，而發(fā)病早期以瘀血阻滯為關(guān)鍵病機。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，結(jié)合臨床體會，筆者認為治療上早期活血化瘀是防治KOA發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。川芎嗪(四甲基毗嗪，ligustrazine)是從活血化瘀類中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿，具有改善關(guān)節(jié)內(nèi)微循環(huán)，降低骨內(nèi)壓作用[4]。近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能促進軟骨細胞的增殖，同時抑制軟骨細胞的凋亡[5]；本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)川芎嗪能明顯降低骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的含量水平，對減輕OA炎癥有一定的作用[6]。本研究通過觀察川芎嗪對實驗性大鼠KOA關(guān)節(jié)軟骨組織病理以及BMP-2、Smad1表達水平的影響來探討其防治OA的機制，為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供有效途徑和應(yīng)用依據(jù)。木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射作為誘導大鼠膝早期骨關(guān)節(jié)炎的方法，已廣泛用于研究[7-8]。本實驗采用木瓜蛋白酶溶液關(guān)節(jié)腔注射制作大鼠KOA模型，并干預6 w后行HE染色切片軟骨Mankin評分，Mankin評分越高，說明軟骨損傷程度越嚴重。其中川芎嗪各劑量組和陽性對照組均較空白組高(P<0.05)，均較模型組低(P<0.05)，且川芎嗪高劑量組<陽性對照組<川芎嗪低劑量組(P<0.05)。這充分說明川芎嗪能減輕關(guān)節(jié)軟骨退變且適當提高血藥濃度，能更好地減輕關(guān)節(jié)軟骨退變程度。

BMP-2作為BMPs 30種蛋白中的一員，已被證明有刺激蛋白多糖的合成，誘導蛋白聚糖和II型膠原的表達，促進軟骨內(nèi)成骨的能力，并具有對軟骨細胞代謝合成代謝的影響[9]。已有研究表明[10]，BMP-2可以提高骨軟骨損傷后軟骨的修復過程，減少纖維軟骨的形成，從而改善軟骨基質(zhì)的外觀和構(gòu)成。長期遞送 BMP-2相比較于自體軟骨細胞移植，前者可以誘導產(chǎn)生更多的透明軟骨[11]。Smad1作為BMP-Smad信號通路的關(guān)鍵分子，其活化是被嚴格并精確調(diào)控的，特別是被大量的負性調(diào)控因子所調(diào)節(jié)，它的負性調(diào)節(jié)對正常的生理功能發(fā)揮有重要的作用[12-13]，Smad1蛋白的表達可能與BMPs信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控的軟骨內(nèi)化骨分子機制間存在相關(guān)性[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA相對表達量較模型組均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，川芎嗪高劑量組BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達量明顯高于陽性對照組(P<0.05)，而川芎嗪低劑量組其表達則均低于陽性對照組。這表明適當提高川芎嗪血藥濃度，可能通過上調(diào)BMP-2mRNA及Smad1mRNA基因的表達，從而促進BMP-2及Smad1蛋白的表達，這可能是在某種程度上減輕關(guān)節(jié)軟骨退變、修復軟骨損傷作用的機制之一。但BMP-2、Smad1及BMP-2mRNA、Smad1mRNA表達上調(diào)后能否進一步激活軟骨細胞特異性的下游靶基因、實現(xiàn)的具體途徑如何，還有待進一步的研究。下一階段將重點研究川芎嗪含藥血清調(diào)節(jié)軟骨細胞的分子機制，為川芎嗪在防治OA方面提供新的科學依據(jù)和實驗方法。