藥用真菌白刺馬勃的生藥學(xué)研究*

徐維茵，李 昂，胡 德，張智超，王淑敏**

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林省生物研究所，吉林 長(zhǎng)春 130012）

白刺馬勃（Lycoperdon wrightii Berk.&Curt.）為馬勃科（Lycoperdaceae） 馬勃屬（Lycoperdon） 大型藥用真菌，入藥部位為干燥子實(shí)體[1]。子實(shí)體成熟后內(nèi)部充滿(mǎn)孢絲和孢子粉，孢子粉可藥用[2]。白刺馬勃味辛、平，入肺經(jīng)，可用于解毒、消腫，更是止血良藥[3]，還可用于治療風(fēng)熱郁肺咽痛，音啞，咳嗽，外用鼻衄，創(chuàng)傷出血[4]。白刺馬勃雖不是《中國(guó)藥典》（2015版） 正品馬勃（脫皮馬勃 Langermannia fenzlii、大馬勃Calvatia gigantea和紫色馬勃Calvatia lilacina）[5]，但民間大部分地區(qū)也將其作馬勃入藥。白刺馬勃由于個(gè)體較小，常易與小馬勃Lycopedon pusillum混淆，因此本文對(duì)白刺馬勃進(jìn)行生藥學(xué)研究，為今后的應(yīng)用研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

XL 30 FEG型電子顯微鏡，F(xiàn)EI公司；YYS-100E型生物顯微鏡，上海圓儀光學(xué)儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)材料

麥角甾醇對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：MUST11070601，純度＞98%；麥角甾酮對(duì)照品，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：X22M8L32255，純度＞96%；甲醇，色譜純，美Fisher公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。白刺馬勃子實(shí)體采集于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)校園草坪，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為白刺馬勃（Lycoperdon wrightii Berk.＆Curt.）。

2 方法

2.1 白刺馬勃的鑒別

2.1.1 基原鑒別

白刺馬勃的原基鑒別，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，白刺馬勃子實(shí)體較小，高 0.5 cm～2.0 cm，直徑 0.5 cm～2.5 cm，生長(zhǎng)初期呈白色，外包被有密集的白色小刺，其尖端成叢聚合成角錐形，后期其小刺脫落，露出淡色的內(nèi)包被。孢子體呈青黃色，不孕基小或無(wú)。生長(zhǎng)在草叢或林下草地上，往往叢生在一起。

圖1 白刺馬勃幼嫩子實(shí)體Fig.1 Young fruiting body of Lycoperdon wrightii

圖2 白刺馬勃成熟子實(shí)體Fig.2 Mature fruiting body of Lycoperdon wrightii

2.1.2 性狀鑒別

白刺馬勃的性狀鑒別，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 白刺馬勃藥材Fig.3 Herbs of Lycoperdon wrightii

由圖3可以看出，白刺馬勃子實(shí)體小，近圓形或陀螺形，或被壓扁，有不規(guī)則凹陷，具短柄。頭部直徑可達(dá)2.5 cm，高可達(dá)2.0 cm。柄基部具纖維質(zhì)叢枝狀假根。老時(shí)表面孢體呈黃褐色，頂部形成開(kāi)口，內(nèi)有黃褐色至暗褐色棉絮狀絲狀物，觸之有褐色孢子飛揚(yáng)。2.1.3 顯微鑒別

白刺馬勃子實(shí)體的顯微鑒別結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。

由圖4和圖5可以看出，光學(xué)顯微鏡下孢子呈球形或卵圓形，淺黃色。電子顯微鏡下孢子呈卵圓形，直徑 3 μm～4.5 μm，表面有細(xì)小疣狀突起，孢子柄短，孢絲線(xiàn)形，近無(wú)色[6]。

圖4 白刺馬勃孢子光鏡下觀察（10×40）Fig.4 Observation on the spores of Lycoperdon wrightii(10×40)

圖5 白刺馬勃孢子電鏡下觀察（10 000×）Fig.5 Observation on the spores of Lycoperdon wrightii（10 00×）

2.1.4 理化性質(zhì)鑒別

火試：取子實(shí)體置于火焰上，輕輕抖動(dòng)，即可見(jiàn)微細(xì)的火星飛揚(yáng)，熄滅后，產(chǎn)生白色濃煙。

薄層鑒別：取白刺馬勃粉末約1 g，加二氯甲烷40 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取麥角

圖6 麥角甾醇對(duì)照品圖（282 nm）Fig.6 Chromatogram of ergosterol(282 nm)

圖8 麥角甾酮對(duì)照品圖（349 nm）Fig.8 Chromatogram of ergotsterone(349 nm)

分別精密稱(chēng)取麥角甾醇和麥角甾酮對(duì)照品適量，加色譜甲醇制成每l毫升含麥角甾醇0.05 mg的溶液和每l毫升含麥角甾酮10 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取白刺馬勃粉末2.0071 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，超聲30 min，放至室溫，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，減壓干燥，殘?jiān)舆m量色譜甲醇使之溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。甾醇和麥角甾酮對(duì)照品，加入甲醇溶解，分別制成每1毫升含麥角甾醇0.5 mg和麥角甾酮0.02 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015版第4部，0502） 試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃） -乙酸乙酯（7:3） 為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2 白刺馬勃麥角甾醇和麥角甾酮的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（ODS-C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水 （96:4），流速 1.0 mL·min-1，柱溫 28℃，進(jìn)樣量10 μL，麥角甾醇檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm，麥角甾酮檢測(cè)波長(zhǎng)為349 nm。理論塔板數(shù)以麥角甾醇峰計(jì)算不得少于10 000，麥角甾酮峰不得少于10 000。記錄色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖一致，見(jiàn)圖6～圖9。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

圖7 白刺馬勃樣品（282 nm）Fig.7 Chromatogram of ergosterol in Lycoperdon wrightii(282 nm)

圖9 白刺馬勃樣品（349 nm）Fig.9 Chromatogram of ergotsterone in Lycoperdon wrightii(349 nm)

3 結(jié)果

3.1 白刺馬勃的鑒別

薄層鑒別結(jié)果見(jiàn)圖10～圖12。

白刺馬勃供試品色譜中有專(zhuān)屬性的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的專(zhuān)屬斑點(diǎn)。噴顯色劑后再置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，有專(zhuān)屬性的藍(lán)色和綠色熒光斑點(diǎn)。

圖10 365 nm紫外光燈下檢視Fig.10 Viewing under 365 nm UV lamp

圖11 顯色后日光燈下檢視Fig.11 Viewing under fluorescent lamp after color rendering

圖12 顯色后365 nm紫外光燈下檢視Fig.12 Viewing under 365 nm UV lamp after color rendering

3.2 麥角甾醇和麥角甾酮含量測(cè)定結(jié)果

3.2.1 方法學(xué)考察

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性范圍的考察

分別取麥角甾醇對(duì)照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，取麥角甾酮對(duì)照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，分別注入液相色譜儀，按照“2.2.1”項(xiàng)條件測(cè)定。麥角甾醇以質(zhì)量（μg） 為橫坐標(biāo)（X），麥角甾酮以質(zhì)量（ng） 為橫坐標(biāo)（X），均以吸收峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），獲得線(xiàn)性回歸方程分別為Y=1 741 574X-1 438 （r=1）、Y=3 186.2X-2 282.9 （r=1）。結(jié)果表明麥角甾醇和麥角甾酮的量分別在 0.1 μg～0.5 μg （r=1）、19.88 μg～139.16 ng（r=1） 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

（2） 精密度考察

分別取麥角甾醇和麥角甾酮對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.2.1”項(xiàng)條件測(cè)定，各重復(fù)6次。測(cè)得麥角甾醇的RSD值為0.12%、麥角甾酮的RSD值為0.19%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

（3） 穩(wěn)定性考察

取白刺馬勃子實(shí)體供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)條件測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，分別測(cè)定其在0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h內(nèi)的峰面積值。測(cè)得白刺馬勃子實(shí)體中麥角甾醇的RSD值為0.23%、麥角甾酮的RSD值為0.44%，結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（4） 重復(fù)性考察

取同一批白刺馬勃子實(shí)體各6份，按照“2.2.3”項(xiàng)條件制備樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得白刺馬勃子實(shí)體中麥角甾醇的RSD值為0.23%、麥角甾酮的RSD值為0.44%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

（5） 加樣回收考察

精密稱(chēng)取已測(cè)定的白刺馬勃子實(shí)體共6份，分別加入一定量的麥角甾醇和麥角甾酮對(duì)照品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)條件制備樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1～表2。

從表1、表2可以看出，白刺馬勃麥角甾醇的平均回收率為100.28%，RSD值為0.39%。麥角甾酮的平均回收率為99.82%，RSD值為0.42%。待測(cè)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在限度范圍內(nèi)，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

3.2.2 樣品含量測(cè)定

表1 白刺馬勃麥角甾醇加樣回收率（n=6）Tab.1 Recovery of ergosterol in Lycoperdon wrightii(n=6)

表2 白刺馬勃麥角甾酮加樣回收率（n=6）Tab.2 Recovery of ergotsterone in Lycoperdon wrightii(n=6)

取白刺馬勃子實(shí)體，按照“2.2.3”項(xiàng)條件制備樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)條件測(cè)定其中麥角甾醇和麥角甾酮的量，以外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算。測(cè)得白刺馬勃子實(shí)體中麥角甾醇平均含量為0.0808 mg·g-1，麥角甾酮的平均含量為 16.4871 μg·g-1。

4 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)白刺馬勃的生態(tài)考證、子實(shí)體的性狀鑒別、孢子的光鏡和電鏡特征觀察以及相應(yīng)的理化性質(zhì)鑒別等研究，建立了綜合鑒別白刺馬勃真?zhèn)蔚姆椒?。薄層色譜結(jié)果表明，白刺馬勃含有麥角甾醇和麥角甾酮成分。經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，麥角甾醇含量為 0.0808 mg·g-1，麥角甾酮含量為16.4871 μg·g-1。麥角甾醇（ergosterol）是真菌類(lèi)的特征甾醇，主要存在于絕大多數(shù)的真菌細(xì)胞膜中，據(jù)報(bào)道麥角甾醇的量與真菌的生物量存在著相關(guān)關(guān)系，是真菌生物量的重要標(biāo)志物之一[7]。生物體中的麥角甾醇量穩(wěn)定，可以麥角甾醇為生物指標(biāo)對(duì)真菌進(jìn)行鑒別[8]。麥角甾醇為脂溶性維生素D2的前體[9]，具有抗癌、防衰老、減毒等功效[10]。麥角甾酮（ergosterone）專(zhuān)屬性強(qiáng)、紫外響應(yīng)值高，且對(duì)其研究較少。因此，建立簡(jiǎn)單、快速的方法測(cè)定馬勃藥材中麥角甾酮含量是必要的。本試驗(yàn)建立的白刺馬勃中麥角甾醇和麥角甾酮含量測(cè)定方法，可作為白刺馬勃質(zhì)量控制的重要檢測(cè)方法，其麥角甾醇和麥角甾酮的含量也為今后白刺馬勃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供借鑒。