有氧運動對糖尿病大鼠心肌組織致纖維化因子的影響及相關(guān)性分析

上官若男，孫景權(quán)，蘇全生

(1.成都大學(xué) 體育學(xué)院，四川 成都 610106；2.北京體育大學(xué) 運動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；3.四川大學(xué) 體育學(xué)院，四川 成都 610065；4.成都體育學(xué)院，四川 成都 610041)

心肌局部的腎素—血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin System，RAS)的生理功能之一是引起心肌肥厚和間質(zhì)纖維化[1]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病高血糖狀態(tài)下，心肌局部交感神經(jīng)活性增加，RAS被激活，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)是RAS的關(guān)鍵酶，ACE活性增加，引起血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)合成增加，AngⅡ作用于心臟局部的I型血管緊張素Ⅱ受體(AT1)，刺激成纖維細胞分泌一種重要的致纖維化因子—轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)[2]。心肌局部AngⅡ含量增加是上調(diào)TGF-β1表達的主要原因[3]。大量研究證實，TGF-β1是組織纖維化病變中最重要的促發(fā)因子[4]。結(jié)締組織生長因子(CTGF)可介導(dǎo)多種組織、器官纖維化，心肌組織中CTGF主要由成纖維母細胞、心肌細胞和內(nèi)皮細胞分泌，具有促進成纖維細胞增殖和基質(zhì)形成的作用[5]。研究表明，TGF-β1可以上調(diào)大鼠心肌CTGF的表達，促進結(jié)締組織細胞增殖和細胞外基質(zhì)的合成，最終引起心肌出現(xiàn)纖維化[6]。心肌膠原纖維以I型膠原纖維(COLI)和III型膠原纖維(COLIII)為主，COLI作為心肌膠原纖維主要成分，是糖尿病心肌纖維化的標(biāo)志纖維。因此，高血糖狀態(tài)下RAS被激活后，ACE活性增加，誘發(fā)AngII合成，激活其下游信號物質(zhì)TGF-β1分泌增加，使CTGF表達增加，最終導(dǎo)致心肌纖維化，即標(biāo)志纖維COLI增多。

運動療法對治療II型糖尿病的長期益處目前已經(jīng)得到公認。已有研究表明，運動可以改善糖尿病患者的糖脂代謝、增加胰島素敏感性、抑制細胞凋亡發(fā)展[7]等。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)運動能降低間歇性低氧誘發(fā)的心肌纖維化程度[8]。國內(nèi)學(xué)者侯改霞等研究發(fā)現(xiàn)運動鍛煉改善II型糖尿病大鼠心肌纖維化的可能通路是AGEs/氧化應(yīng)激/NF-κB P65[9]。對于運動是否可以通過調(diào)節(jié)心肌組織RAS的功能從而延緩糖尿病心肌病的發(fā)展，目前還鮮見報道。本研究旨在觀察有氧運動對II型糖尿病大鼠心肌組織AngⅡ、TGF-β1、CTGF等的影響，探討8周游泳運動保護糖尿病大鼠心臟的機制是否與RAS有關(guān)，為運動鍛煉改善糖尿病誘發(fā)心肌纖維化提供理論支持。

1 研究對象與方法

1.1 II型糖尿病大鼠模型建立及動物分組

SPF級雄性8周齡Wistar大鼠45只，體重200～230 g，由四川大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(川)2013-026]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。隨機抽取32只作為實驗組(DM組和DME組)，以高糖高脂飼料(10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽酸鈉，66.5%普通飼料)喂養(yǎng)7周以誘導(dǎo)胰島素抵抗，其余13只大鼠作為正常組(C組和CE組)以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。高糖高脂飲食7周后，空腹12 h，按30 mg/kg(將STZ溶于0.1 mol/L，pH為4.2的枸櫞酸緩沖液中)體重的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司)，72 h后尾靜脈采血，監(jiān)測非禁食血糖>16.7 mmol·L-1者為造模成功，正常大鼠注射等體積的枸櫞酸緩沖液。去除高糖高脂喂養(yǎng)過程中死亡5只和未達到血糖標(biāo)準(zhǔn)的7只大鼠，共有20只大鼠建模成功。將正常大鼠和造模成功大鼠隨機分為4組，空白對照組(C組，n=7)、單純運動組(CE組，n=6)、糖尿病對照組(DM組，n=10)、糖尿病運動組(DME組，n=10)。

7周高糖高脂膳食期間所有動物每天稱重，造模成功后所有大鼠每周稱重一次，每天觀察大鼠一般情況。

1.2 運動方案

CE組和DME組大鼠采用改進的Ploug訓(xùn)練方案，無負重游泳。將DM和DME組大鼠STZ注射72 h后及C和CE組大鼠枸櫞酸緩沖液注射72 h后的時間定義為基線時間，成模后先進行2次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，每次10 min。訓(xùn)練程序為每周訓(xùn)練6 d，第1周前3 d訓(xùn)練時間分別為20 min、30 min和45 min，第4 d起每天持續(xù)游泳60 min，共訓(xùn)練8周。

1.3 動物取材

最后一次運動結(jié)束后，禁食但不禁水12 h，稱重，腹腔注射10%水合氯醛溶液(按3.5 mL/kg注射)麻醉大鼠，腹主動脈抽血，同時摘取心臟，取左心室心肌組織200 mg，勻漿，離心，取上清。

1.4 指標(biāo)測試

心肌組織AngⅡ、TGF-β1、CTGF、COLI和COLIII采用雙位點夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有測試結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間數(shù)據(jù)比較采用SPSS 17.0軟件Univariate法進行統(tǒng)計，組內(nèi)差異比較采用Paired-Samples T Test統(tǒng)計，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異具有顯著性，P<0.01為差異具有非常顯著性。

2 結(jié)果

實驗期間由于糖尿病并發(fā)癥導(dǎo)致死亡、操作疏忽導(dǎo)致大鼠溺亡等原因，C組、CE組、DM組、DME組最終參與統(tǒng)計的有效樣本量分別為6只、5只、7只、6只。

2.1 運動干預(yù)對各組大鼠心肌組織AngII、TGF-β1、CTGF、COLI和COLIII水平的影響

表1 運動干預(yù)后各組大鼠心肌組織AngII、TGF-β1和CTGF含量變化

注：★表示與C組相比P<0.05，★★表示與C組相比P<0.01；▲表示與CE組相比P<0.05，▲▲表示與CE組相比P<0.01；●表示與DM組相比P<0.05，●●表示與DM組相比P<0.01。表2同此

與C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05圖1 運動干預(yù)后各組大鼠心肌組織AngII含量變化

心肌組織AngII含量變化由表1和圖1可知。運動干預(yù)8周后，與C組相比，DM組心肌組織AngII含量顯著升高(P<0.05)，表明II型糖尿病大鼠心肌組織中AngII含量顯著升高。與DM組相比，DME組心肌組織AngII含量顯著降低(P<0.05)。表明8周游泳運動顯著降低II型糖尿病大鼠心肌組織中AngII含量。

心肌組織TGF-β1水平變化情況由表1和圖2可知。與C組相比，CE組心肌組織TGF-β1水平與C組幾乎保持同一水平，DM組心肌組織TGF-β1水平顯著高于C組(P<0.05)，表明II型糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1含量顯著升高。與DM組相比，DME組心肌組織TGF-β1水平顯著降低(P<0.05)，表明8周游泳運動顯著降低II型糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1含量。

與 C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05。圖2 運動干預(yù)后各組大鼠心肌組織TGF-β1含量變化

與C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05圖3 運動干預(yù)后各組大鼠心肌組織CTGF含量變化

心肌組織CTGF水平變化情況由表1和圖3可知。與C組相比，DM組心肌組織CTGF水平非常顯著性升高(P<0.01)，表明II型糖尿病大鼠心肌組織中CTGF含量顯著升高。DM組和DME組心肌組織CTGF水平與CE組相比，均無顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn)DME組心肌組織CTGF水平低于DM組，但在統(tǒng)計學(xué)上不具有顯著性差異，表明8周游泳運動有降低II型糖尿病大鼠心肌組織中CTGF含量的趨勢。

表2 運動干預(yù)后各組大鼠心肌組織COLI和COLIII含量變化

由表2和圖4可知：8周運動后，DM組大鼠心肌組織COLI顯著高于C組(P<0.05)，DME組大鼠心肌組織COLI顯著低于DM組(P<0.05)。DM組和DME組大鼠心肌組織COLIII高于C組和CE組但無顯著性差異(P>0.05)，DME組大鼠心肌組織COLIII低于DM組，但無顯著性差異(P>0.05)。

注：與C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05圖4 運動干預(yù)后各組大鼠心肌組織COLI和COLIII含量變化

2.2 AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)性分析

表3 CTGF、TGF-β1和AngII之間相關(guān)矩陣

注：**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；*在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。表4同此

由表3和圖5A可知TGF-β1與CTGF之間存在顯著正相關(guān)(r=0.577，P<0.01)。由表3和圖5 B可知TGF-β1與AngII之間不存在相關(guān)性(r=0.146，P>0.05)。由表3和圖5C可知CTGF和AngII之間相關(guān)系數(shù)r=0.293，相關(guān)程度較低，同時P值>0.05，因此兩者之間也不存在相關(guān)性。

2.3 COLI與AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)性分析

表4 COLI與AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)矩陣

由表4和圖6 A可知COLI與AngII之間存在顯著正相關(guān)(r=0.695，P<0.01)。由表4和圖6 B可知COLI與TGF-β1之間相關(guān)系數(shù)r=0.422，相關(guān)程度較好，但是P值為0.064，說明COLI與TGF-β1之間存在可能相關(guān)性。由表4和圖6 C可知COLI與CTGF之間不存在相關(guān)性(r=0.222，P>0.05)。

A：TGF-β1與CTFG之間相關(guān)圖。B：TGF-β1與AngII之間相關(guān)圖。C：CTGF和AngII之間相關(guān)圖圖5 TGF-β1、CTGF和AngII之間相關(guān)圖

A：AngII與COLI之間相關(guān)圖。B：TGF-β1與COLI之間相關(guān)圖。C：CTGF與COLI之間相關(guān)圖圖6 AngII、TGF-β1和CTGF與COLI之間相關(guān)圖

3 分析與討論

研究表明：8周有氧運動顯著降低糖尿病大鼠心肌組織中AngⅡ、CTGF、COLI和TGF-β1含量；TGF-β1與CTGF之間存在顯著正相關(guān)，TGF-β1、CTGF與AngII之間均不存在相關(guān)性；COLI與AngII之間存在顯著正相關(guān)，COLI與TGF-β1之間存在可能相關(guān)性，COLI與CTGF之間不存在相關(guān)性。因此我們得出：有氧運動對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用可能與長期有氧運動降低心肌組織中AngⅡ、TGF-β1和CTGF的含量有關(guān)；有氧運動改善糖尿病大鼠心肌膠原纖維化的潛在靶點可能是RAS中纖維化因子AngII。

國內(nèi)外的研究均表明，糖尿病心肌病時，心肌組織AngII的濃度明顯升高[10]。賀慧杰[11]在對不同病程糖尿病大鼠心肌病變致纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)：對照組同期相比，糖尿病1月、3月組大鼠心肌組織AngII和TGF-β1含量均顯著升高，提示AngII和TGF-β1在糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)的發(fā)生發(fā)展中是一個重要的生化因子。CTGF作為一種新型的致纖維化因子，具有誘導(dǎo)成纖維細胞增殖和細胞外間質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)合成的功能，從而引起心肌細胞肥大、心肌肥厚和心肌間質(zhì)纖維化，影響心臟舒縮功能。多數(shù)研究證實[12-13]，糖尿病心肌病大鼠心肌組織CTGF表達顯著增高，且伴隨著心肌組織膠原含量和ECM合成增加，提示CTGF是導(dǎo)致心肌肥大、間質(zhì)纖維化的重要因子。研究發(fā)現(xiàn)：II型糖尿病大鼠心肌組織AngII、TGF-β1和CTGF含量顯著高于正常大鼠組，說明在糖尿病的發(fā)病過程中，心肌局部RAS被激活，AngII作為RAS中強有力的效應(yīng)分子，與AT1受體結(jié)合后發(fā)揮生物效應(yīng)，AngII含量的升高刺激成纖維細胞分泌TGF-β1增加，結(jié)合我們實驗室前期研究，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心組織出現(xiàn)明顯纖維化等心肌病特征。另外，CTGF作為TGF-β1致纖維化的下游因子，糖尿病狀態(tài)下心肌組織TGF-β1的升高上調(diào)了CTGF的表達[14]。因此，我們也認為AngII、TGF-β1和CTGF是糖尿病心肌病發(fā)病過程中重要的致病因子。

長期規(guī)律的適宜運動可以引起心臟生理性肥大，提高心肌收縮力，是心臟對運動的良好適應(yīng)。但是病理性心肌肥大則表現(xiàn)為心肌收縮力下降和心功能降低。無論是生理性還是病理性心臟肥大，心肌組織AngII均參與心肌間質(zhì)膠原重構(gòu)。田振軍[15]研究證實在中等強度有氧運動導(dǎo)致心肌肥大和心臟功能增強的同時，AngII表現(xiàn)為升高。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動后正常大鼠心肌組織AngII含量升高，推測可能是長期規(guī)律的適宜運動引起心肌生理性肥大，提高心肌收縮能力，AngII含量升高是機體對運動的良好適應(yīng)。另外，對于高血壓誘發(fā)病理性心肌肥大來說，長期中等強度有氧運動可以顯著降低高血壓大鼠血漿和心肌組織AngII含量、改善心功能指標(biāo)，提示運動可以有效改善AngII介導(dǎo)的心肌肥大[16]。同時研究發(fā)現(xiàn)適宜有氧運動可以降低肥胖大鼠心肌組織ACE mRNA、AT1受體和CTGF的表達，從而使心肌纖維化早期良性逆轉(zhuǎn)。由這些研究我們認為有氧運動可能是通過降低心肌纖維化因子AngII和CTGF等指標(biāo)從而改善病理性心肌肥大。我們研究發(fā)現(xiàn)運動干預(yù)8周后，糖尿病運動組大鼠心肌組織AngII 、TGF-β1和 CTGF含量顯著低于糖尿病大鼠，說明長期規(guī)律的適宜運動通過下調(diào)糖尿病大鼠AngII、TGF-β1和CTGF的表達，從而有效抑制了心肌局部RAS的活性。

通過AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)：TGF-β1與CTGF之間存在顯著正相關(guān)，AngII與TGF-β1之間以及AngII和CTGF之間均不存在相關(guān)性。TGF-β1在心肌組織的高表達可以上調(diào)其下游因子CTGF的表達，但是兩者之間是否存在相關(guān)關(guān)系未見報道。另外研究也發(fā)現(xiàn)純化的心肌細胞有CTGF的基礎(chǔ)表達，給予TGF-β1刺激可以明顯上調(diào)其表達[17]。然而矛盾的是本研究并未發(fā)現(xiàn)AngII與TGF-β1和CTGF之間存在相關(guān)關(guān)系，其原因可能是TGF-β和AngII之間存在多個相互作用機制，作為纖維化發(fā)生的啟動者，AngII能夠通過直接方式和間接方式同時增加TGF-β1轉(zhuǎn)錄和合成[18]；也有可能由本研究樣本量較少引起。 另外，有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病心肌纖維化病程中，心肌組織AngII可以通過刺激TGF-β1的表達間接增加心肌組織CTGF的表達，也可直接刺激CTGF的表達，表明CTGF可以不依賴TGF-β1的活性而獨立介導(dǎo)心肌纖維化和心肌功能障礙。AngII的致纖維化作用不僅是通過TGF-β1，還通過它的其他下游信號調(diào)節(jié)物(如炎癥因子、PAI-1和ILK)來發(fā)揮作用[19]。

大量研究證實當(dāng)糖尿病心臟出現(xiàn)明顯肥厚時，心肌間質(zhì)內(nèi)已出現(xiàn)大量膠原纖維增多現(xiàn)象。心肌膠原纖維以I型膠原纖維(COLI)和III型膠原纖維(COLIII)為主，其中I型占心肌總膠原纖維的80%以上，III型占11%[20]。COLI作為心肌膠原纖維主要成分，其是糖尿病心肌纖維化的標(biāo)志纖維。本研究發(fā)現(xiàn)心肌局部RAS中與COLI呈顯著正相關(guān)的因子為AngII，次之為TGF-β1，COLI與CTGF無相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)心肌局部AngII含量與心肌組織TGF-β1表達與大鼠心肌舒張功能呈負相關(guān)，認為AngII和TGF-β1的增加可促使心肌膠原含量增加，ECM重構(gòu)而致心臟功能障礙[21]。周敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)心肌TGF-β1和AngII與心肌超微結(jié)構(gòu)的改變呈一致性，認為心肌局部TGF-β1和AngII的增加參與了心肌肥厚及間質(zhì)纖維化的形成。AngII作為RAS的主要效應(yīng)物，是心肌細胞纖維化發(fā)生的主要啟動子，而TGF-β1是AngII發(fā)揮促纖維化作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。因此，這就解釋了AngII和TGF-β1與心肌纖維化標(biāo)志膠原纖維COLI顯著相關(guān)的原因。然而，本研究中發(fā)現(xiàn)COLI與CTGF無相關(guān)性。2008年Brooks BA等研究發(fā)現(xiàn)血漿中CTGF含量與早期II型糖尿病心臟功能障礙無關(guān)系[23]，其原因可能是在病程4、8、12周，糖尿病大鼠心肌組織CTGF表達呈持續(xù)增高趨勢，心肌組織TGF-β1在病程第12周時呈下降趨勢，心肌中TGF-β1首先誘導(dǎo)纖維化，CTGF則維持纖維化的發(fā)展。由本文前部分研究可知，TGF-β1與CTGF含量之間存在正相關(guān)，鑒于TGF-β1與COLI相關(guān)，推測COLI與CTGF應(yīng)該相關(guān)。然而，AngII除了通過TGF-β1/CTGF通路發(fā)揮致纖維化作用，還可以通過ROS/HIF1發(fā)揮作用[24]，這就解釋了CTGF與COLI無相關(guān)性的可能機制。

4 結(jié)論

1)有氧運動對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用可能與長期有氧運動降低心肌組織中AngⅡ、TGF-β1和CTGF的含量有關(guān)。

2)有氧運動改善糖尿病大鼠心肌膠原纖維化的潛在靶點可能是RAS中纖維化因子AngII。