白芨多糖提取的工藝優(yōu)化

劉長(zhǎng)命，王潔

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

白芨［Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.］又名白給、連及草等，產(chǎn)地主要在我國(guó)廣西、貴州、云南、四川、陜西南部等[1]。白芨是蘭科白芨屬的藥用植物，對(duì)細(xì)菌和其他病原菌微生物均有抑菌和殺菌作用[2]。干燥的白芨塊莖味苦甘澀，性平微寒，歸肺、胃、肝經(jīng)，其功效主要有補(bǔ)肺、消腫、收斂止血、散結(jié)逐腐、生肌斂瘡等，被稱為“外科最善”[3]。研究表明，白芨乙醇浸提液可抑制枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、變形球菌、大腸桿菌及人型結(jié)核桿菌[4]。目前，在臨床醫(yī)學(xué)上，白芨塊莖的藥

用成分較多，但主要為白芨多糖（Bletilla striata polysaccharide，BSP），又稱白芨膠[5]。 據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)表明，國(guó)內(nèi)研究白芨藥用成分主要集中在中醫(yī)中藥的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)階段，而對(duì)其不同方法提取時(shí)最優(yōu)提取工藝條件及抗菌活性研究較少，對(duì)抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、生物安全性等機(jī)制方面的研究亟待深入[6-7]。白芨多糖在醫(yī)學(xué)研究上有諸多的應(yīng)用，不僅具有抑菌作用，還是一種優(yōu)良的天然生物黏附材料，在作為藥物載體等方面有其獨(dú)特作用，然而對(duì)其最優(yōu)提取工藝條件研究還較少[8-9]。本研究通過水提醇沉法對(duì)商洛白芨的多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選最優(yōu)的提取工藝條件，并比較云南、貴州與商洛栽培白芨中的白芨多糖含量，為當(dāng)?shù)匕总纲Y源的進(jìn)一步開發(fā)利用及栽培引種提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

商洛白芨［Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.］采自商洛市丹鳳縣兩年生栽培，云南、貴州白芨分別為云南文山和貴州赤水的兩年生栽培。

1.2 方法

1.2.1 材料的準(zhǔn)備

將新鮮的白芨塊莖流水下洗凈，切片后置于恒溫干燥箱中，42℃烘48 h至無水分即可。將干燥后的白芨塊莖經(jīng)小型粉碎機(jī)粉碎后，過80 mm的藥典篩，得白芨粉末。

1.2.2 白芨多糖提取預(yù)試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取白芨粉末3 g置于錐形瓶中，加入60 mL的蒸餾水，在80℃水浴鍋中溫育2 h，四層紗布過濾，將濾液收集。濾渣繼續(xù)加水提取2次，將3次提取的濾液合并后，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，至原體積的1/3。向濃縮后的濾液中加入Sevager試劑（氯仿：正丁醇=5：1），濾液與Sevager試劑的體積之比為 5：1，充分震蕩搖勻，3500r·min－1離心10 min，取上清液，加入三倍體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀，充分?jǐn)嚢韬?，密封，室溫下靜置一夜，抽濾后真空冷凍干燥，得白芨粗多糖。稱重后保存于－20℃冰箱待測(cè)。

1.2.3 白芨多糖提取單因素試驗(yàn)

以料液比（材料質(zhì)量g/所用溶劑的體積mL）、提取溫度(℃)、提取時(shí)間(h)、醇沉濃度(%)為四因素設(shè)置四水平的單因素試驗(yàn)，如表1所示，其余步驟同方法 1.2.2，提取得到白芨粗多糖。

表1 白芨的糖提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.4 白芨多糖提取正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，篩選出單因素中的料液比、提取溫度、提取時(shí)間、醇沉濃度各因素中白芨多糖含量最多的一個(gè)水平值，上下取值，其余按1.2.2的步驟進(jìn)行，得白芨粗多糖。由于在單因素試驗(yàn)中，醇沉濃度為85%時(shí)獲得的白芨多糖含量最高，故綜合考慮后選擇對(duì)白芨多糖含量影響相近的料液比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平，見表2。

表2 白芨多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取 D-葡萄糖對(duì)照品，配置成 2.5 g·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配[10]。分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 于試管中， 對(duì) 應(yīng) 加 入 0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mL 蒸餾水， 再各加 1 mL 的 5%苯酚溶液、5 mL的濃硫酸，震蕩搖勻后，靜置30 min。以蒸餾水做對(duì)照，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，以 OD值(Y)為縱坐標(biāo)，得出線性方程與相關(guān)系數(shù)分別為 Y=0.009 8X+0.026 8，R2=0.996 5，表明線性關(guān)系良好。

1.2.6 白芨多糖含量的測(cè)定

參照雷于國(guó)等[11]的方法，將干燥的白芨多糖粉碎后，精密稱取0.01g，加入適量蒸餾水在磁力攪拌器60℃下充分溶解后，定容至100 mL，配成樣品溶液。吸取1 mL樣品溶液于試管中，加入1 mL的5%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，震蕩搖勻，靜置30 min，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。將OD值代入回歸方程，得其濃度，白芨多糖含量計(jì)算公式為：

白芨多糖含量W（%）=(樣品濃度C×樣品定容后的體積V/樣品的質(zhì)量m)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)白芨多糖含量的影響

取4個(gè)錐形瓶，各加入5 g白芨粉末，再分別加入 75、100、125、150 mL 蒸餾水，80 ℃提取2 h后重復(fù)提取兩次，三次重復(fù)。其余操作同方法 1.2.2，結(jié)果見表3。

表3 料液比對(duì)白芨多糖含量的影響

由表3可知，隨著料液比的增加，多糖含量逐漸降低，料液比1：15與其他組達(dá)顯著性差異水平。雖然料液比為1：30時(shí)多糖含量較料液比為1：25有顯著升高，但仍顯著低于料液比為1：15的含量，且其提取得率也低。綜合考慮后續(xù)濃縮、醇沉等工藝，取料液比1：15為最佳條件。

2.1.2 溫度對(duì)白芨多糖含量的影響

取4個(gè)錐形瓶，各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸餾水，分別在60℃、70℃、80℃、90℃下提取2 h，重復(fù)提取兩次，三次重復(fù)。其他操作同方法1.2.2，結(jié)果見表4。

表4 溫度對(duì)白芨多糖含量的影響

由表4可知，隨著溫度的提高，多糖含量不斷降低，提取溫度60℃時(shí)獲得的白芨多糖在同因素中最多，與提取溫度80℃和90℃呈顯著性差異，且其得率也最高。因而，白芨多糖的最佳提取溫度選擇60℃。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)白芨多糖含量的影響

取4個(gè)錐形瓶，各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸餾水，80 ℃下分別提取 1.5、2、2.5、3 h，重復(fù)提取兩次，設(shè)三次重復(fù)。 其他操作同方法 1.2.2，結(jié)果見表5。

表5 提取時(shí)間對(duì)白芨多糖含量的影響

由表5可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，白芨多糖含量呈降低趨勢(shì)，提取1.5 h與3 h的多糖含量達(dá)顯著性差異水平，得率也最高，而與2 h和2.5 h差異不顯著。分析其原因可能是由于隨著提取時(shí)間的增加，致使較多雜質(zhì)成分的溶出。因而，綜合考慮確定1.5 h為最佳提取時(shí)間。

2.1.4 醇沉濃度對(duì)白芨多糖含量的影響

取4個(gè)錐形瓶，各加入5 g白芨粉末和100 mL蒸餾水，80℃下加熱2 h，重復(fù)提取兩次，合并提取液，濃縮至原體積的1/3，除去雜蛋白后，分別用65%、75%、85%、95%乙醇沉淀過夜，三次重復(fù)。 其他操作同方法 1.2.2，結(jié)果見表6。

表6 醇濃度對(duì)白芨多糖含量的影響

由表6可知，不同的醇沉濃度對(duì)白芨多糖含量影響較大，以85%的醇濃度沉淀所獲得的多糖含量最高，顯著高于其他各組。而其得率又低于其他醇濃度，尤其是顯著低于95%醇濃度的多糖得率。綜合考慮，確定醇沉淀濃度為85%。

在進(jìn)行白芨多糖單因素提取的過程中，主要考慮白芨多糖的含量，而白芨多糖的得率在工業(yè)生產(chǎn)方面也是需要考慮的重要方面。因而本研究的單因素采用了以多糖含量為主，提取得率為輔的方法進(jìn)行白芨多糖含量的最佳提取條件優(yōu)選。單因素試驗(yàn)確定的白芨多糖提取最優(yōu)條件為：料液比為 1：15，提取溫度 60 ℃，提取時(shí)間 1.5 h，醇沉濃度為85%。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.2.1 白芨多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

以影響白芨多糖含量相近的3個(gè)因素即料液比（g：mL）、提取溫度（℃）、提取時(shí)間（h）為優(yōu)選因素，每個(gè)因素下設(shè)定三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表7。

表7 白芨多糖提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過表7直觀分析表明，各因素對(duì)白芨多糖含量的影響大小為B>A>C，即提取溫度>料液比>提取時(shí)間。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)上得出理論上最佳提取條件為A3B3C1，即料液比1：20，提取溫度70℃，提取時(shí)間1 h。但通過L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果（表8）及相關(guān)資料表明，在9組試驗(yàn)中的第9組，白芨多糖的提取條件為A3B3C2，即料液比為1：20，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為1.5 h為正交試驗(yàn)中的最佳提取條件。

表8 白芨提取多糖含量正交試驗(yàn)的極差分析

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定更適宜的白芨多糖提取工藝條件，將理論上最佳提取工藝與正交試驗(yàn)中最佳工藝進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。

通過表9可以直觀看出，理論上最佳提取工藝的白芨多糖得率和含量均比正交試驗(yàn)中最佳提取工藝的要高，多糖得率高出了5.133%，多糖含量高出6.734%。因而，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)得出白芨多糖提取最佳工藝條件為A3B3C1，即料液比1：20，提取溫度70℃，提取時(shí)間1 h。

表9 理論與正交試驗(yàn)最佳白芨多糖提取工藝的驗(yàn)證結(jié)果

2.3 不同產(chǎn)地白芨多糖含量比較

分別稱取來自陜西商洛、云南文山和貴州赤水的白芨材料粉末3 g，按料液比1：20加入60 mL蒸餾水，70℃下加熱提取1 h，過四層紗布得濾液，再重復(fù)提取兩次，合并濾液，濃縮，除蛋白，85%乙醇醇沉過夜，其余操作同方法 1.2.2，比較結(jié)果見圖1。

由圖1可知，利用優(yōu)化的工藝條件所提取的白芨多糖在云南文山白芨中含量最高，達(dá)75.22%，其次是陜西商洛白芨，為 57.98%，貴州赤水白芨的含量最低，為54.92%。三個(gè)地區(qū)的白芨多糖得率相差均不超過1%，表明該優(yōu)化工藝條件適宜于白芨多糖的提取。

圖1 不同產(chǎn)地白芨多糖含量比較

3 討論與結(jié)論

張雪嬌等[12]利用加熱煮沸回流法提取白芨膠中糖含量達(dá)75.1%，本研究通過單因素和正交試驗(yàn)方法確定的白芨多糖提取的最優(yōu)工藝條件得到的結(jié)果與其類似，即料液比1：20，提取溫度70℃，提取時(shí)間1 h，白芨多糖含量可達(dá)75.22%。而趙會(huì)然等[13]對(duì)云南部分蘭科植物多糖提取工藝研究認(rèn)為，以40倍水70℃加熱提取2 h后，加適量95%乙醇在4℃下醇沉12 h為蘭科植物多糖的最佳工藝條件，并且重復(fù)性好。常影等[14]認(rèn)為粗葉懸鉤子根多糖提利用水提醇沉法以溫度90℃，時(shí)間2 h，料液比1：15效果最好。本研究利用不同醇濃度沉淀時(shí)發(fā)現(xiàn)，95%醇溶液可獲得較高的多糖得率，但多糖含量卻顯著低于85%的醇濃度，分析可能是由于醇沉的時(shí)間及溫度所導(dǎo)致，或是不同白芨多糖在不同的醇沉濃度下分離出來的分子量不同而異[15-16]。

本研究所得的最佳工藝條件為料液比1：15，提取溫度70℃，提取時(shí)間1 h，這與趙會(huì)然等[13]對(duì)云南部分蘭科植物多糖提取的研究結(jié)果相似，因提取溫度在幾個(gè)因素中影響最大，而這兩個(gè)研究結(jié)果均為70℃；本研究而與趙寧等[3]對(duì)白芨多糖以料液比 1：10在 90℃提取 1.5 h的結(jié)論不同，原因是在多糖的提取過程中，實(shí)驗(yàn)材料的來源、醇沉?xí)r的濃度以及實(shí)驗(yàn)前的處理不同，也將影響其研究結(jié)果。

在白芨多糖提取過程中，提取方法較多，但各有利弊。韓欣等[17]對(duì)白芨多糖提取方法討論中提到溶劑提取法不需特殊設(shè)備、成本低，是最常用方法。趙會(huì)然等[13]在白芨多糖提取方法認(rèn)為采用超聲波輔助提取時(shí)，多糖得率與熱水提取相當(dāng)，純度也相近，加大超聲功率有助于多糖釋放溶出，但因超聲波對(duì)多糖鏈存在一定破壞，故還原糖含量也隨之升高；醇水提取雖成本較水提高，但因在提取前將醇溶性雜質(zhì)除去，有效提高多糖純度，減少后期純化步驟。因而本研究采用了水提醇沉法提取白芨多糖，不僅提取率較高，也較方便，成本也較低。

同時(shí)，本研究通過比較不同產(chǎn)地栽培白芨的多糖含量發(fā)現(xiàn)，云南文山的白芨多糖含量最高，達(dá)75.22%，商洛白芨的多糖含量低于云南白芨，為 57.98%，貴州白芨的多糖含量最低，為54.92%。而劉長(zhǎng)命等[18]利用超聲波輔助提取法對(duì)三個(gè)不同產(chǎn)地的野生白芨多糖含量研究表明，商洛野生白芨的多糖含量最高，達(dá)78.87%，表明商洛地區(qū)的野生白芨具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，但在引種栽培方法方面還有待于提高。