電化學(xué)發(fā)光法高靈敏檢測(cè)左氧氟沙星

李哲建，樊雪梅，王書(shū)民

（商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院/陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西商洛 726000）

左氧氟沙星[1]（LVFX）系第三代喹諾酮類(lèi)抗生素，對(duì)細(xì)菌、支原體及部分厭氧菌有效，廣泛應(yīng)用于臨床系統(tǒng)感染，服用不當(dāng)或長(zhǎng)期使用，會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)、中樞神經(jīng)反應(yīng)等不良反應(yīng)，致病菌易產(chǎn)生耐藥性，因此檢測(cè)左氧氟沙星具有重要意義。目前測(cè)定左氧氟沙星的方法有紫外光譜法[2-3]、熒光光譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳法[8]、電化學(xué)發(fā)光分析法[9]以及化學(xué)發(fā)光法[10]等，但這些方法存在操作復(fù)雜、靈敏度較低、動(dòng)態(tài)范圍窄、操作繁瑣等缺點(diǎn)。因此，建立一種檢測(cè)左氧氟沙星的新方法十分必要。電化學(xué)發(fā)光（ECL）技術(shù)具有高靈敏度、寬動(dòng)態(tài)范圍、易操作、可控的電位性等優(yōu)點(diǎn)[11]。聯(lián)吡啶釕/Nafion/AuNPs(Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs)復(fù)合膜在電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)的應(yīng)用研究中在很短時(shí)間內(nèi)得到了迅速發(fā)展。原因在于Nafion是一種離子交換型聚合物，具有很高的抗化學(xué)侵蝕性質(zhì)和成膜性質(zhì)，金納米粒子良好的導(dǎo)電性和較大的比表面積[12]，這樣Nafion/AuNPs復(fù)合物就能夠穩(wěn)定有效的固定Ru(bpy)32+，從而有效確保Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光的超強(qiáng)穩(wěn)定性，提高了分析檢測(cè)效率。本文利用Nafion/AuNPs復(fù)合膜包埋穩(wěn)定Ru(bpy)32+的固定技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了Ru(bpy)32+高效穩(wěn)定的固定，成功組裝在修飾電極表面，制備出Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE修飾電極，利用該修飾電極對(duì)左氧氟沙星的電化學(xué)發(fā)光性能進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

左氧氟沙星注射液（0.2 g，100 mL，石家莊四藥有限公司），左氧氟沙星結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。釕聯(lián)吡啶化合物Ru(bpy)32+，Nafion（全氟代磺酸脂），氯金酸和檸檬酸鈉購(gòu)自Sigma公司；三丙正胺（Tri-n-propylamine，簡(jiǎn)稱(chēng) TPrA）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。磷酸鹽緩沖溶液（PBS），用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制；其它所用化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

圖1 左氧氟沙星的結(jié)構(gòu)式

透射電子顯微鏡（TEM）（JEOL，JEM-2100，日本）；電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)全程使用MPI-E型電化學(xué)發(fā)光儀（西安瑞邁電子公司）。電化學(xué)發(fā)光采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，工作電極是玻碳電極（直徑2.0 mm）及修飾電極，參比電極為裝有飽和KCl溶液的Ag/AgCl電極，對(duì)電極是鉑片電極。-600 V設(shè)為檢測(cè)時(shí)光電倍增管（PMT）的高壓。電化學(xué)測(cè)量過(guò)程使用CHI 660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）。pHS-25型pH計(jì)購(gòu)于上海雷磁儀器廠(chǎng)；KQ-100B型超聲波清洗器購(gòu)于昆山超聲儀器有限公司。

1.2 裸電極預(yù)處理

直徑2 mm的玻碳電極用粒徑為0.3 μm和0.05 μm的Al2O3泥漿中打磨拋光，然后依次用體積比1：1的硝酸、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗2 min，最后用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.3 金納米粒子的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[12]利用檸檬酸鹽還原法制備金納米粒子。先將氯金酸配制成0.01%的溶液，取50 mL氯金酸溶液加熱至沸騰后再往里面加入1%的檸檬酸三鈉溶液5.6 mL，當(dāng)看到淡黃色的氯金酸水溶液經(jīng)灰色、黑色、紫色的顏色變化，最終變?yōu)榧t色時(shí)，繼續(xù)加熱和攪拌12 min后，停止加熱，然后繼續(xù)攪拌溶液15 min后至溶液呈室溫。最后，將該溶液轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶中于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AuNPs/Nafion/GCE修飾電極的制備

將制備好的納米金分散于Nafion中，于高速混合儀上混合20 min，制得Nafion/AuNPs懸浮液。取10 μL AuNPs/Nafion混合后的懸浮液均勻滴到預(yù)先處理干凈的玻碳電極表面，在空氣中自然晾干，待電極表面形成一層均勻的薄膜后，即得AuNPs/Nafion/GCE修飾電極。

1.5 電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備

滴加AuNPs/Nafion懸浮液到預(yù)先處理好的玻碳電極表面，自然晾干后再滴加10 μL Ru(bpy)32+得到Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs修飾的玻碳電極，將該傳感器避光保存于4℃環(huán)境下備用。用 0.01 mol·L-1pH=7.4 的 PBS 溶液沖洗電極，除去電極表面多余的Ru(bpy)32+，最終可制得修飾電極Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE，即得電化學(xué)發(fā)光傳感器。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米粒子表征

金納米粒子的透射電鏡分析譜圖見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，制備納米粒子粒徑為納米級(jí)的，表面較光滑，形狀為圓球狀，粒徑大約為10 nm。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法的可行性

在預(yù)先處理好的玻碳電極上滴加 5.0 μL 0.5 mg·mL-1的 Nafion/AuNPs懸浮液，室溫晾干，再滴加 5.0 μL 1.0 ×10-5mol·L-1的 Ru(bpy)32+溶液，室溫晾干備用，形成Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE修飾電極，即為電化學(xué)發(fā)光傳感器。由于Nafion具有良好的成膜效應(yīng)，Nafion帶負(fù)電和三聯(lián)吡啶釕帶正電，二者由于靜電作用相互吸引，使三聯(lián)吡啶釕能夠穩(wěn)定的固定在電化學(xué)發(fā)光傳感界面上。為了證明該實(shí)驗(yàn)方法的可行性，采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行研究。對(duì)比了修飾的玻碳電極上存在目標(biāo)物左氧氟沙星和不存在目標(biāo)物左氧氟沙星的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。圖3為修飾電極與不同濃度的左氧氟沙星反應(yīng)后檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。曲線(xiàn)a為不存在左氧氟沙星時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度非常低。曲線(xiàn)b為1.0×10-11mol·L-1的左氧氟沙星與修飾電極結(jié)合后的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。當(dāng)左氧氟沙星濃度繼續(xù)升高為5.0×10-10mol·L-1時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也顯著增強(qiáng)（如曲線(xiàn)c所示）。這表明隨著溶液中左氧氟沙星的濃度增加電極的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。因此，修飾電極Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE可用于檢測(cè)左氧氟沙星。

圖2 金納米粒子的TEM圖

圖3 不同濃度左氧氟沙星對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

2.3 雜交時(shí)間優(yōu)化

本文對(duì)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)雜交時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，以獲得所制電化學(xué)發(fā)光傳感器優(yōu)良性能。圖4為Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE修飾電極與目標(biāo)物1.0×10-11mol·L-1左氧氟沙星的雜交時(shí)間與電化學(xué)發(fā)光積分值的變化關(guān)系圖，從圖4中可以看出在30 min之前電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值隨雜交時(shí)間的增加急劇增加。到60 min后電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，為確保Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE和目標(biāo)物充分雜交，70 min被選為雜交時(shí)間。

圖4 雜交時(shí)間對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

2.4 檢測(cè)范圍和靈敏度

圖5為相同的修飾電極在不同濃度左氧氟沙星與其對(duì)應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，圖5分析研究了電化學(xué)發(fā)光傳感器與不同濃度左氧氟沙星相互作用，在此實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)左氧氟沙星進(jìn)行了定量檢測(cè)。由圖5可以可知，當(dāng)左氧氟沙星的濃度不斷增大時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也越強(qiáng)，同時(shí)也可以驗(yàn)證出左氧氟沙星對(duì)聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)有較強(qiáng)的增敏作用。圖6為不同濃度的左氧氟沙星與其在修飾電極上電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的校準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明，隨著左氧氟沙星溶液濃度的不斷增大，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值也不斷增大。以三次平行測(cè)量左氧氟沙星所得電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值對(duì)左氧氟沙星濃度的對(duì)數(shù)作圖在5.0×10-12～1.0×10-9mol·L-1的濃度范圍內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度與其左氧氟沙星的濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系， 線(xiàn)性方程為I=1.634×106+1.36×105logC，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R=0.994 3，檢出限(S/N=3)為3.0×10-12mol·L-1。結(jié)果表明,相對(duì)于電化學(xué)發(fā)光法[9]和化學(xué)發(fā)光法[10]具有較高的靈敏度和較低的檢出限。而且無(wú)需加入雜交指示劑，使操作程序大大簡(jiǎn)化。

2.5 傳感器的重現(xiàn)性和貯存穩(wěn)定性

通過(guò)研究5支按相同方法制備的修飾電極與同一濃度（1.0×10-10mol·L-1）的左氧氟沙星雜交前后電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化值來(lái)考察傳感器的重現(xiàn)性，5支電極測(cè)定結(jié)果的RSD為5.2%。結(jié)果表明，該電化學(xué)發(fā)光傳感器測(cè)定左氧氟沙星有良好的重現(xiàn)性。構(gòu)制的傳感器不用時(shí)4℃下于PBS中避光保存。在15 d后,考察修飾電極Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE 傳感器對(duì) 1.0×10-10mol·L-1的左氧氟沙星的響應(yīng)情況，結(jié)果顯示，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度值保持穩(wěn)定，該穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明所構(gòu)建的傳感器具有良好的貯存穩(wěn)定性。

圖5 電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與左氧氟沙星濃度間的線(xiàn)性關(guān)系

圖6 電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值與左氧氟沙星濃度的校準(zhǔn)曲線(xiàn)

3 結(jié)論

本文以三聯(lián)吡啶釕為信號(hào)物質(zhì)，以左氧氟沙星為目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)，以金納米粒子作為放大信號(hào)物質(zhì)，構(gòu)制了一種高靈敏測(cè)定藥物的電化學(xué)發(fā)光傳感器。因?yàn)榻鸺{米粒子良好的導(dǎo)電性和較大的比表面積，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光信號(hào)聯(lián)吡啶釕的具有增大的氧化還原電流，所以導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光信號(hào)也有很大增強(qiáng)。該傳感器具有制作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，從而為DNA雜交傳感器的設(shè)計(jì)、以及藥物的檢測(cè)提供了有益借鑒。