輪蟲(chóng)在生態(tài)毒理學(xué)中的研究進(jìn)展

沙婧婧，戴媛媛，潘玉龍，李娟，徐兆東，張繼民,*

1. 國(guó)家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，青島 266033 2. 國(guó)家海洋局海洋溢油鑒別與損害評(píng)估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266033 3. 山東省海洋生態(tài)環(huán)境與防災(zāi)減災(zāi)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266033 4. 天津渤海水產(chǎn)研究所 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院渤海研究中心，天津 300457

海洋浮游動(dòng)物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其群落結(jié)構(gòu)的多樣性和穩(wěn)定性對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)影響甚遠(yuǎn)。輪蟲(chóng)(Rotifera)是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的次級(jí)生產(chǎn)者之一，起著關(guān)鍵性的承上啟下作用，自身所獨(dú)具的眾多優(yōu)勢(shì)特征頗有研究前景，其生活周期短，且具有兩性生殖方式，具有對(duì)毒物的敏感性、超強(qiáng)的實(shí)用性和培養(yǎng)的簡(jiǎn)易性，已經(jīng)成為研究水生生態(tài)學(xué)、物種形成、進(jìn)化與性別演變、種群動(dòng)力學(xué)以及生態(tài)毒理學(xué)重要的模式生物[1]。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)將輪蟲(chóng)視作無(wú)脊椎動(dòng)物中進(jìn)行環(huán)境毒性測(cè)試最有前途的分類群[2]。因此，針對(duì)污染物對(duì)輪蟲(chóng)的生態(tài)毒理效應(yīng)進(jìn)行探討研究對(duì)于海洋生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)和保護(hù)具有重要意義。

在過(guò)去的幾十年里，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)輪蟲(chóng)在環(huán)境污染物及其他脅迫因素下的實(shí)驗(yàn)研究大幅增加，尤其在它們的生態(tài)功能、地理系統(tǒng)發(fā)育、基因組學(xué)領(lǐng)域以及行為、生理生化和分子響應(yīng)方面，展開(kāi)了一系列的研究[1,3-8]。作為水生浮游動(dòng)物的主要種類，輪蟲(chóng)的生態(tài)毒理學(xué)研究獲得較大發(fā)展，特別是學(xué)者們[4-5,9]開(kāi)始更多地關(guān)注對(duì)輪蟲(chóng)的分子和生理生化水平的影響，并取得了一些成果。通過(guò)基因表達(dá)的分析使得學(xué)者們能夠更深入地掌握毒性效應(yīng)的分子機(jī)制。輪蟲(chóng)可以作為毒物及其代謝產(chǎn)物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的有用工具，且能通過(guò)其發(fā)現(xiàn)毒物最終進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)的方式。在內(nèi)分泌干擾方面，相比于橈足類和枝角類，輪蟲(chóng)對(duì)雄激素和抗雄激素物質(zhì)特別敏感[10-11]。且相對(duì)于橈足類和枝角類等水生浮游動(dòng)物，輪蟲(chóng)具有實(shí)驗(yàn)周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)?？傮w來(lái)說(shuō)，對(duì)輪蟲(chóng)的生物毒性測(cè)試和基因表達(dá)研究相結(jié)合，讓我們能夠更加全面地了解污染物作用的毒性機(jī)制。本綜述的目的是為了界定在生態(tài)毒理學(xué)研究中，輪蟲(chóng)作為重要的水生無(wú)脊椎動(dòng)物模式生物的特征和潛能。本文對(duì)輪蟲(chóng)在生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述并加以展望，以期為輪蟲(chóng)在生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用提供參考和拓寬思路。

1 輪蟲(chóng)的特點(diǎn)及其生活史(The characteristics and life history of rotifers)

1.1 輪蟲(chóng)的特點(diǎn)

輪蟲(chóng)是一種微小的多細(xì)胞動(dòng)物，有些種類營(yíng)底棲、附著或固著生活，無(wú)游泳能力或游泳能力極弱、有些種類則營(yíng)浮游或兼性浮游生活，在水中自由游動(dòng)。輪蟲(chóng)身體不分節(jié)，但具有兩側(cè)對(duì)稱的特征，具有假體腔，因此大多數(shù)動(dòng)物學(xué)家將輪蟲(chóng)歸屬為假體腔動(dòng)物(Pseudocoelomata)。根據(jù)輪蟲(chóng)胚胎發(fā)育過(guò)程和超微結(jié)構(gòu)的差異，輪蟲(chóng)動(dòng)物門(Rotifera)可分為單巢綱(Monogononta)、雙巢綱(Digononta)和尾盤綱(Seisonidea)，單巢綱分游泳目(Ploima)和簇輪蟲(chóng)目(Flosculariacea)，大約有90%的輪蟲(chóng)屬于單巢綱。輪蟲(chóng)屬于后生水生生物，在17世紀(jì)后期的列文·虎克時(shí)期即被人了解，通常體長(zhǎng)在100 ～ 1 000 μm之間，最小的僅有40 μm左右，最大的可達(dá)到4 mm，迄今已知約2 150種[12]。

輪蟲(chóng)由于個(gè)體較小，培養(yǎng)所用的水體體積小，甚至可以用微升加以培養(yǎng)，因此可用很微量的測(cè)試物來(lái)進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)。輪蟲(chóng)雌雄異體，雄性個(gè)體小，僅有纖毛環(huán)和精巢，專為有性生殖交配。雌性較為常見(jiàn)，個(gè)體大。輪蟲(chóng)的內(nèi)部器官比較齊全，具備神經(jīng)、消化、排泄、生殖等器官系統(tǒng)，如圖1所示。輪蟲(chóng)最主要的三大特征為：輪盤、咀嚼器和原腎管。根據(jù)以上特征，就能夠明顯地將輪蟲(chóng)與其他水生動(dòng)物區(qū)別開(kāi)來(lái)[13]。

作為受試生物，輪蟲(chóng)在生態(tài)毒理學(xué)研究中具有比其他浮游動(dòng)物更明顯的優(yōu)勢(shì)，能夠作為水質(zhì)變化的敏感的生物指示物。這些優(yōu)勢(shì)包括個(gè)體體型較小、世代時(shí)間短、生殖速度快、能縮短毒性試驗(yàn)時(shí)間、對(duì)很多有毒物質(zhì)都具有較強(qiáng)的敏感性、主要進(jìn)行孤雌生殖、培養(yǎng)技術(shù)易行、具有較高的種群密度和種群增長(zhǎng)率等，詳見(jiàn)表1所列。輪蟲(chóng)屬全球分布，實(shí)驗(yàn)材料可得性強(qiáng)，且輪蟲(chóng)休眠卵已能進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，同批次得到的休眠卵能使試驗(yàn)材料基本生理狀況保持一致，減小實(shí)驗(yàn)誤差。休眠卵能夠存儲(chǔ)較長(zhǎng)時(shí)間，可在需要的時(shí)候隨時(shí)孵化進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。這些特征使得輪蟲(chóng)被作為評(píng)估環(huán)境污染物對(duì)生態(tài)環(huán)境影響的重要模式生物。

輪蟲(chóng)分布廣、繁殖快、大小適中、易培養(yǎng)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的動(dòng)物性餌料，目前廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)性培養(yǎng)的是褶皺臂尾輪蟲(chóng)(Brachionusplicatilis)[12]。輪蟲(chóng)是中上層水體中魚(yú)類和其他經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的理想開(kāi)口餌料，雖然它們體型微小，但因?yàn)槠潺嫶蟮姆N群規(guī)模，以及快速增長(zhǎng)的高周轉(zhuǎn)率和一定條件下的孤雌生殖，大大增加了其在水生系統(tǒng)中的次級(jí)生產(chǎn)力。輪蟲(chóng)由于其高代謝活動(dòng)，可以從浮游生物和顆粒有機(jī)質(zhì)中高效率再生得到營(yíng)養(yǎng)作為食物[23]，因而在水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成、物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞過(guò)程中具有重要的作用。輪蟲(chóng)對(duì)毒物的敏感性強(qiáng)，且生命表簡(jiǎn)單，能大大縮短試驗(yàn)時(shí)間，從而減輕勞動(dòng)強(qiáng)度和降低成本。實(shí)驗(yàn)表明，利用輪蟲(chóng)2 d種群增長(zhǎng)研究環(huán)境毒物的影響，可與網(wǎng)紋溞(Ceriodaphniaquadrangula)7 d生命表測(cè)試相當(dāng)，且靈敏度更高，而實(shí)驗(yàn)人員勞動(dòng)強(qiáng)度和資金投入僅占使用網(wǎng)紋溞作為受試生物的70%[16]。國(guó)外學(xué)者Persoone和Janssen[24]發(fā)現(xiàn)輪蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的毒性敏感性比大型溞(Daphniamagna)更加敏感。美國(guó)和一些歐洲國(guó)家已經(jīng)把褶皺臂尾輪蟲(chóng)和萼花臂尾輪蟲(chóng)(Brachionuscalyciflorus)作為海水和淡水中污染物的生態(tài)毒理受試生物，用于監(jiān)測(cè)化工和農(nóng)藥生產(chǎn)廠家排放污水的毒性。此外，運(yùn)用不同種類的輪蟲(chóng)進(jìn)行毒性試驗(yàn)也可作為適合生物測(cè)試系統(tǒng)的一個(gè)綜合性多層次的方法[25]。

1.2 輪蟲(chóng)的生殖方式及生活史

褶皺臂尾輪蟲(chóng)的生殖方式有孤雌生殖和有性生殖2種，2種生殖方式可交替進(jìn)行。輪蟲(chóng)雌體在適宜的生態(tài)條件下均進(jìn)行孤雌生殖，所產(chǎn)的卵不需要受精，立即發(fā)育孵化為雌體，這種卵稱非混交卵(又名夏卵)，產(chǎn)非混交卵的雌體稱非混交雌體。非混交雌體和非混交卵的細(xì)胞核中都含有雙倍的染色體；當(dāng)環(huán)境條件惡化時(shí)，如饑餓、密度過(guò)高、缺氧、水質(zhì)突變等，一些輪蟲(chóng)開(kāi)始進(jìn)行有性生殖。有性生殖過(guò)程具有實(shí)現(xiàn)基因重組，增加種群遺傳多樣性特點(diǎn)，這有助于提高輪蟲(chóng)種群對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力。其世代周期短，繁殖速度快，能在較短時(shí)間里獲得實(shí)驗(yàn)所需要的數(shù)量，可快速進(jìn)行輪蟲(chóng)生命表研究、進(jìn)行種群參數(shù)分析。非混交雌體所產(chǎn)的卵在成熟前經(jīng)減數(shù)分裂，卵細(xì)胞核內(nèi)的染色體為單倍體，這種卵稱為混交卵，未經(jīng)受精的混交卵發(fā)育為雄體，經(jīng)受精的混交卵稱受精卵(又被稱為冬卵或休眠卵)[26]。休眠卵一端有空隙，體積比夏卵大，卵殼厚，一般呈橘黃色，其有厚的卵殼保護(hù)，能抵抗干燥、低溫、高溫或水質(zhì)變化等不利的環(huán)境條件，且具有應(yīng)對(duì)污染物脅迫較強(qiáng)的抵抗力。休眠卵沉到水底待休眠期滿且溫度、溶氧、滲透壓等水質(zhì)環(huán)境條件適宜時(shí)才發(fā)育孵化出非混交雌體[1, 12-13]。

2 輪蟲(chóng)在常規(guī)毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用(Application of rotifers in conventional toxicity evaluation)

最常用的常規(guī)的毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法有2種：即急性和慢性毒性試驗(yàn)。急性毒性實(shí)驗(yàn)是研究在較短時(shí)間內(nèi)毒物對(duì)輪蟲(chóng)的毒性效應(yīng)，一般以存活率作為指標(biāo)；而慢性毒性實(shí)驗(yàn)是在急性毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，當(dāng)毒物在特定時(shí)間內(nèi)對(duì)輪蟲(chóng)的毒性較小時(shí)，其毒性作用可能是緩慢的，一般不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)使其致死，只是導(dǎo)致其機(jī)體的生理生化和行為異常，但最終的結(jié)果會(huì)使其出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、繁殖量下降、雌雄比例變化、個(gè)體死亡、種群密度下降等癥狀[1]。目前，在常規(guī)毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)中，對(duì)于淡水污染物評(píng)價(jià)最常應(yīng)用的受試生物是萼花臂尾輪蟲(chóng)，海水污染物評(píng)價(jià)則多用褶皺臂尾輪蟲(chóng)。美國(guó)試驗(yàn)材料學(xué)會(huì)(American Society for Testing and Materials，ASTM)(ASTM，1991)也已將萼花臂尾輪蟲(chóng)和褶皺臂尾輪蟲(chóng)分別作為淡水和海水的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物[27]。

圖1 輪蟲(chóng)雌體模式圖[14]注：a.頭冠纖毛；b.前棘刺；c.原腎管；d.肌肉；e.咀嚼器；f.食道；g.胃；h.被甲；i.伸縮泡；j.后棘刺；k.足；l.趾。Fig. 1 Structure pattern of female rotifer[14]Note: a. corona cilia; b. front caltrops spine; c. nephridial canal; d. muscle; e. trophi; f. esophagus; g. stomach; h. carapace; i. contractile vacuole; j. back caltrops spine; k. foot; l. toe.

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

輪蟲(chóng)急性毒性實(shí)驗(yàn)最初主要致力于對(duì)致死率的研究。急性毒性實(shí)驗(yàn)通常用半數(shù)致死濃度(LC50)作為首選的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，并在輪蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)中廣泛使用[28-29]。國(guó)外學(xué)者首先展開(kāi)了一系列對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究。1989年，Couillard等[30]測(cè)定了6種重金屬離子對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的24 h-LC50；1991年，Snell等[31]以萼花臂尾輪蟲(chóng)為受試生物，通過(guò)測(cè)定24 h-LC50，對(duì)多達(dá)28種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行急性毒性評(píng)估；1992年，F(xiàn)ernandez等[32]對(duì)多種農(nóng)藥進(jìn)行了急性毒性評(píng)價(jià)，測(cè)定了甲基對(duì)硫磷、殺草丹、馬拉硫磷、硫丹、二嗪農(nóng)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的24 h-LC50；1994年，Liber等[33]通過(guò)12 h 和24 h 急性毒性實(shí)驗(yàn)，研究了2，3，4，6-四氯酚和五氯苯酚對(duì)矩形龜甲輪蟲(chóng)(Keratellaquadrala)和萼花臂尾輪蟲(chóng)的毒性作用。從以上研究可以看出，輪蟲(chóng)致死率測(cè)試終點(diǎn)多集中在24 h。由于輪蟲(chóng)生命周期短，生殖速度快，短時(shí)間內(nèi)會(huì)產(chǎn)出下一代，這會(huì)在一定程度上對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生很大的影響。因此，目前多采用24 h-LC50作為輪蟲(chóng)急性毒性測(cè)試的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，而探索易于操作并能適當(dāng)延長(zhǎng)試驗(yàn)周期的輪蟲(chóng)毒性試驗(yàn)方法仍然具有重要的生態(tài)毒理學(xué)意義。1999年，金解敏等[34]研究了銅、鋅離子對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性作用，為我國(guó)輪蟲(chóng)毒理學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，但與國(guó)外相比，還存在較大差距；2007年，謝欽銘等[35]研究了孔雀石綠、高錳酸鉀和甲醛3種藥物對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性，結(jié)果顯示，這3種藥物對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的毒性作用均隨濃度的升高而增強(qiáng)。隨著多年來(lái)的不斷探索，對(duì)國(guó)際上統(tǒng)一的輪蟲(chóng)急性毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化方法的應(yīng)用日趨規(guī)范和成熟。美國(guó)試驗(yàn)材料學(xué)會(huì)(ASTM)將輪蟲(chóng)作為海水監(jiān)測(cè)生物列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并且已形成了一套完善的參考標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范的操作流程[36]。據(jù)此，測(cè)試條件的持續(xù)時(shí)間和測(cè)試種的年齡均可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 輪蟲(chóng)在生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的優(yōu)勢(shì)Table 1 Advantages of rotifers in experimental studies

然而，實(shí)際環(huán)境中存在的復(fù)合污染作用機(jī)理復(fù)雜，影響因素較多，越來(lái)越多的研究希望通過(guò)設(shè)置不同毒物配比方式，評(píng)價(jià)不同污染物對(duì)輪蟲(chóng)的聯(lián)合毒性效應(yīng)，尋找其作用規(guī)律，以期為聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)研究積累理論數(shù)據(jù)。2015年，沙婧婧等[37]以多溴聯(lián)苯醚中的BDE-47和BDE-209作為脅迫因子，以褶皺臂尾輪蟲(chóng)為受試生物，研究其單一及聯(lián)合急性毒性效應(yīng)。二者聯(lián)合作用時(shí)，分別采用濃度1:1和毒性1:1進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)用水生毒理聯(lián)合效應(yīng)Marking相加指數(shù)法評(píng)價(jià)二者對(duì)輪蟲(chóng)的聯(lián)合毒性，2種試驗(yàn)配比方式得到的結(jié)果類似，96 h內(nèi)隨著暴露時(shí)間的增加，BDE-47和BDE-209對(duì)其聯(lián)合毒性作用從協(xié)同作用轉(zhuǎn)變?yōu)檩p微的拮抗作用；2016年，Zhang等[38]為探究重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)輪蟲(chóng)的毒性影響，以萼花臂尾輪蟲(chóng)為受試動(dòng)物，選擇Cu2+、Zn2+、Cd2+、Cr6+和Mn2+等5種重金屬，采用相加指數(shù)法開(kāi)展了其24 h 聯(lián)合急性毒性作用的評(píng)價(jià)研究。目前，國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者們已逐漸重視并積極開(kāi)展對(duì)輪蟲(chóng)聯(lián)合毒性作用方面的研究。對(duì)于致毒機(jī)理不盡相同的混合污染物而言，在評(píng)價(jià)其聯(lián)合毒性效應(yīng)時(shí)，都需進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)研究后方可定論，不能簡(jiǎn)單由單一急性毒性相加來(lái)判斷其毒性。聯(lián)合急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅豐富了輪蟲(chóng)生態(tài)毒理學(xué)研究的基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為開(kāi)展評(píng)價(jià)復(fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供理論數(shù)據(jù)和科學(xué)參考。急性毒性實(shí)驗(yàn)中，類似LC50的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)還有LT50，為半數(shù)致死時(shí)間，即在給定毒物濃度的條件下殺死半數(shù)測(cè)試物種數(shù)量所需要的時(shí)間[39]。但如果污水中的有毒物質(zhì)濃度太低，輪蟲(chóng)不能在特定的時(shí)間內(nèi)達(dá)到50%的死亡率。此種情況下，就會(huì)進(jìn)一步采用慢性毒性實(shí)驗(yàn)方法。

2.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

慢性毒性是指以低劑量外來(lái)化合物長(zhǎng)期給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸，觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。慢性毒性試驗(yàn)的目的是確定外來(lái)化合物的毒性下限，即長(zhǎng)期接觸該化合物可以引起機(jī)體危害的閾劑量和無(wú)作用劑量，了解其毒作用特點(diǎn)、靶器官和毒性機(jī)制，且觀察受試生物是否具有毒性作用的可逆性[40-42]。輪蟲(chóng)的慢性毒性實(shí)驗(yàn)在個(gè)體水平、基因表達(dá)、生理生化、種群和群落水平也有一系列的指標(biāo)。個(gè)體水平的反應(yīng)，包括復(fù)雜的生理(食物選擇、消費(fèi)、同化等)和行為(游泳速度改變、麻木、垂直遷移等)的相互作用?；蚨拘苑矫?，毒物進(jìn)入輪蟲(chóng)體內(nèi)后，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)引起輪蟲(chóng)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響[9]。生理生化方面，變化較為顯著的酶活性測(cè)試結(jié)果往往可從毒物對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的亞急性、慢性實(shí)驗(yàn)中獲得[43]。輪蟲(chóng)在毒物脅迫下的大多數(shù)生命表參數(shù)和種群統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)呈現(xiàn)出的變化，是對(duì)有毒物質(zhì)產(chǎn)生作用的重要響應(yīng)。種群增長(zhǎng)率和最大種群密度是毒物脅迫作用下的2個(gè)顯著的生物指標(biāo)[11, 44]。在絕大多數(shù)情況下，有毒物質(zhì)能夠降低測(cè)試物種的最大種群密度。輪蟲(chóng)的最大種群密度和種群增長(zhǎng)率在實(shí)驗(yàn)室條件下常用于慢性毒性試驗(yàn)的結(jié)果衡量。例如，銅對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)繁殖的抑制在出現(xiàn)死亡個(gè)體之前就已經(jīng)顯現(xiàn)[1]。Snell和Hicks[45]應(yīng)用褶皺臂尾輪蟲(chóng)作為受試生物，進(jìn)行慢性毒性實(shí)驗(yàn)，研究比較聚苯乙烯納米粒子在自然海水和人工海水中的生態(tài)毒性，研究表明，毒性效應(yīng)與顆粒大小有關(guān)，較大的顆粒(≥100 nm)會(huì)誘導(dǎo)輪蟲(chóng)在胃腸中積累顆粒直到排泄，而較小的顆粒(50 nm)則可能由細(xì)胞攝入，可從輪蟲(chóng)母體轉(zhuǎn)移到卵子，致使其生育率和攝食率的下降，從而導(dǎo)致了最大種群密度和種群增長(zhǎng)率的降低。同樣地，Jeong等[6]通過(guò)慢性毒性實(shí)驗(yàn)，也檢測(cè)到了輪蟲(chóng)暴露在含納米顆粒等微塑料的水體中，其體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化劑反應(yīng)會(huì)受到顯著影響。目前，利用輪蟲(chóng)評(píng)價(jià)環(huán)境激素效應(yīng)已應(yīng)為學(xué)術(shù)界普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。我國(guó)有學(xué)者以淡水水體中普遍存在的萼花臂尾輪蟲(chóng)為受試動(dòng)物，研究了4種環(huán)境激素，包括雙酚A(bisphenolA)、阿特拉津(atrazine)、西維因(carbaryl)和久效磷(monocrotophos)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的生活史、無(wú)性生殖和有性生殖的影響[46]。眾多學(xué)者們之所以選擇輪蟲(chóng)作為慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究的模式生物，主要是由于其本身的研究?jī)?yōu)勢(shì)和在水生態(tài)系統(tǒng)種群動(dòng)態(tài)中起重要作用，以及在生態(tài)毒理學(xué)中具有標(biāo)準(zhǔn)化和可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

為能在較短的時(shí)間內(nèi)經(jīng)濟(jì)而靈敏地檢測(cè)出毒物對(duì)輪蟲(chóng)的生殖毒性，1992年，Snell等[17]提出輪蟲(chóng)短期慢性毒性實(shí)驗(yàn)方法，在體積為12 mL的輪蟲(chóng)培養(yǎng)液中(內(nèi)含食物)接種6個(gè)0～2 h內(nèi)的輪蟲(chóng)幼體，于25 ℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)48 h，然后計(jì)數(shù)培養(yǎng)液中的輪蟲(chóng)，以種群增長(zhǎng)率作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。1994年，Janssen等[47]在1 mL 的輪蟲(chóng)培養(yǎng)液中接種5只輪蟲(chóng)幼體，于25 ℃下培養(yǎng)72 h。發(fā)現(xiàn)以此得到的種群增長(zhǎng)率比2 d種群增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)所得到的更接近最大值。據(jù)此，2002年，Radix 等[48]應(yīng)用該方法研究了環(huán)境雌激素壬基酚(nonylphenol)等對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生殖的影響；2004年，Xi和Feng[49]也以此方法研究了除草劑草甘膦(glyphosate)和甲基托布津(thiophanate-methyl)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖和無(wú)性生殖的影響。Preston和Snell[50]提出與以上的靜態(tài)研究方法相似的4 d輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)方法，在12 mL輪蟲(chóng)培養(yǎng)液中接種6只輪蟲(chóng)幼體，靜態(tài)培養(yǎng)96 h后計(jì)數(shù)其中輪蟲(chóng)休眠卵總數(shù)，以輪蟲(chóng)的休眠卵產(chǎn)量作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。這些短期慢性毒性實(shí)驗(yàn)方法在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出毒物的毒性，能為進(jìn)一步探討毒物影響輪蟲(chóng)生殖的機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

2.3 對(duì)輪蟲(chóng)行為的影響

用行為學(xué)分析評(píng)估污染物的生物毒性作用有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樾袨榉磻?yīng)迅速[51-53]。例如測(cè)定魚(yú)的行為已經(jīng)在許多檢測(cè)項(xiàng)目中成為可接受的方法[54]?？傮w來(lái)說(shuō)，在輪蟲(chóng)的生態(tài)毒理學(xué)研究中僅少數(shù)的研究使用其行為特征作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。然而，由于其行為的變化是高度一致的，因此，使用的行為測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)也非常適用于急性毒性實(shí)驗(yàn)。Janssen等[55]在淡水輪蟲(chóng)萼花臂尾輪蟲(chóng)對(duì)于特定毒物的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)輪蟲(chóng)的游泳速度、路徑、曲折度、活動(dòng)周期與毒性物質(zhì)銅、五氯苯酚(PCP)、3，4-二氯苯胺(DCA)和林丹存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即隨著有毒物質(zhì)濃度的增加，游泳行為通常會(huì)受到抑制。Ramírez-Pérez等[56]研究了汞對(duì)輪蟲(chóng)游泳行為的影響。Snell和Joaquim-Justo[57]指出，當(dāng)接觸到有毒物質(zhì)后，輪蟲(chóng)通常降低游泳速度，最終下沉。而有些化學(xué)物質(zhì)則只是增加了輪蟲(chóng)游泳的曲折度[58-59]。以上現(xiàn)象對(duì)理解一個(gè)潛在的有毒物質(zhì)可以影響和干擾個(gè)體乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)功能尤其重要。用行為測(cè)試獲得的2 h-EC50與用同種測(cè)試物種從傳統(tǒng)的急性毒理測(cè)試中獲得的24 h-LC50是一樣的數(shù)量級(jí)。相對(duì)于獲得半致死濃度(LC50)，輪蟲(chóng)的行為(如游泳速度)變化可能在更短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)即可得到。研究表明，輪蟲(chóng)游泳行為特性的變化可以被視為敏感而快速的檢測(cè)毒物脅迫作用的指標(biāo)。此外，回避行為經(jīng)常發(fā)生水平低于公布的基于許多水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的半致死濃度(LC50)[57]?；乇芸梢愿淖冚喯x(chóng)的生存和繁衍，導(dǎo)致輪蟲(chóng)豐度的降低和將能量轉(zhuǎn)移到更高的營(yíng)養(yǎng)級(jí)。

低濃度或無(wú)毒的化學(xué)物質(zhì)，包括低濃度的重金屬和農(nóng)藥，已被證明能夠擾亂有機(jī)體化學(xué)信息的傳輸[38]。擾亂化學(xué)信息系統(tǒng)所需的濃度通常較低[60]。2種類型的輪蟲(chóng)行為反應(yīng)通常被選用于檢測(cè)污染物的毒性效應(yīng)：游泳活動(dòng)(即游泳的速度和曲折度)[61]和攝食[62]。對(duì)毒物最敏感的階段是有性生殖階段[50]。然而，通過(guò)對(duì)物種之間的比較研究發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有任何一個(gè)單一物種能夠?qū)λ谢衔锒季哂凶罡呙舾卸萚63]。

傳統(tǒng)的生態(tài)毒理學(xué)研究通常以給定的暴露時(shí)間來(lái)描述劑量-效應(yīng)關(guān)系而忽略暴露過(guò)程和之后潛在的毒性影響。Chen等[64]在農(nóng)藥樂(lè)果的毒性作用下對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)進(jìn)行攝食行為評(píng)估，不僅在暴露時(shí)間內(nèi)，也在暴露后的時(shí)段內(nèi)評(píng)估。當(dāng)輪蟲(chóng)暴露于0.2 mg·L-1和1.0 mg·L-1的農(nóng)藥時(shí)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，能夠明顯觀察到3階段的階梯式脅迫作用，即輪蟲(chóng)的攝食行為歷經(jīng)了“應(yīng)激興奮(stimulation)”、“適應(yīng)與調(diào)整(acclimation)”以及“毒性作用”(toxic effects)3個(gè)階段。而高濃度組1.8 mg·L-1的樂(lè)果對(duì)輪蟲(chóng)在整個(gè)作用過(guò)程中只造成了一步的“毒性作用”，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)階段變化趨勢(shì)，可以很明顯地觀察到樂(lè)果對(duì)輪蟲(chóng)攝食行為的抑制作用，推測(cè)可能是該濃度已經(jīng)超過(guò)了輪蟲(chóng)的忍耐閾值，使得身體機(jī)能受到了損害，無(wú)法產(chǎn)生應(yīng)激興奮或適應(yīng)。此外，盡管輪蟲(chóng)的攝食行為在暴露結(jié)束后有一定的恢復(fù)，但在暴露結(jié)束后8 h攝食速率甚至?xí)艿礁笠种?。這種暴露后的潛在抑制效應(yīng)與暴露濃度和時(shí)間有關(guān)。研究表明，農(nóng)藥樂(lè)果對(duì)輪蟲(chóng)攝食行為的影響具有高度的過(guò)程依賴性，可在暴露過(guò)程中引起逐步的脅迫作用，在暴露后造成潛在的毒性。抗癌藥物作為一種新興的環(huán)境污染物受到越來(lái)越多的關(guān)注。以類似的研究方法，2017年，學(xué)者們研究了抗癌藥物伊馬替尼(imatinib)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)攝食行為的影響[65]。此研究也充分考慮到了藥物暴露之后和再暴露的影響。通過(guò)提高伊馬替尼的濃度來(lái)評(píng)估輪蟲(chóng)的攝食行為。盡管過(guò)濾和攝食速率在暴露結(jié)束后有一定程度的恢復(fù)，但是顯著的攝食抑制效應(yīng)仍舊持續(xù)存在。在再次暴露過(guò)程中，攝食行為受到的抑制作用低于第一次暴露，推測(cè)這說(shuō)明輪蟲(chóng)可能對(duì)同一種毒素產(chǎn)生了一定的耐受性。對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(AchE)的活性和活性氧(ROS)水平也進(jìn)行了檢測(cè)。伊馬替尼在暴露過(guò)程中和再暴露時(shí)抑制了AchE活性，而在再暴露過(guò)程中ROS水平顯著提升。上述研究提供了新的綜合評(píng)價(jià)毒物潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的方法。

3 環(huán)境污染物脅迫對(duì)輪蟲(chóng)的毒性影響(Toxicity of environmental pollutants to rotifers)

3.1 重金屬

作為水體中常見(jiàn)的污染物之一，重金屬離子具有在水體中難降解、存留時(shí)間長(zhǎng)等特性，不僅能直接危害水生生物，且能通過(guò)食物鏈的富集作用對(duì)更高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的消費(fèi)者構(gòu)成威脅，最終危害人類健康，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害[66]。因此，對(duì)水生生物進(jìn)行重金屬毒性研究有著十分重要的意義。早在20世紀(jì)70年代初，學(xué)者們就開(kāi)始采用輪蟲(chóng)作為受試生物來(lái)評(píng)價(jià)重金屬對(duì)水體的污染[67-68]。之后，相關(guān)研究呈現(xiàn)猛增之勢(shì)。Builkema[69]首次嘗試應(yīng)用輪蟲(chóng)作為受試生物評(píng)價(jià)重金屬離子毒性，獲得理想效果。痕量金屬可以維持生物體內(nèi)重要酶代謝功能的正常發(fā)揮、體內(nèi)生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能、參與生物體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)等，是正常代謝所必需的；但是當(dāng)其存在過(guò)多時(shí)，就會(huì)對(duì)生物體構(gòu)成危害，如誘導(dǎo)輪蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，構(gòu)成氧化脅迫(oxidative stress)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的異常凋亡或壞死。而那些非必需重金屬如錫、鉛、銀等，由于基本上不具有生物功能，當(dāng)其痕量存在時(shí)，即可對(duì)輪蟲(chóng)產(chǎn)生毒害作用[70]。不同重金屬對(duì)同一種輪蟲(chóng)的毒性存在很大差異。銅等5種金屬對(duì)無(wú)甲腔輪蟲(chóng)(Lecaneinermis)的毒性大小依次是銅>鋁>鐵>鋅>錫>錳[71]。而不同種類的輪蟲(chóng)對(duì)同一種重金屬的抵抗力也有所不同。Arias-Almeida和Rico-Martínez[72]發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于臂尾屬和腔輪屬的輪蟲(chóng)而言，大肚須足輪蟲(chóng)(Euchlanisdilatata)對(duì)鎘、鉛和汞的毒性都更加敏感。此外，重金屬對(duì)輪蟲(chóng)的慢性毒性隨著重金屬濃度的升高而愈發(fā)顯著。相關(guān)研究顯示，Cd2+和Cu2+隨著濃度的升高均對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的存活率、繁殖率、凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率有更加顯著的抑制作用，而混交百分率和休眠卵數(shù)量也明顯增加[66]。Sarma等[73]也發(fā)現(xiàn)輪蟲(chóng)的種群數(shù)量會(huì)隨著水體中Cu2+和Cd2+的濃度增大而顯著減少。重金屬還能夠影響輪蟲(chóng)體內(nèi)抗逆蛋白等的表達(dá)。分別暴露于一定濃度的Cu2+和Cd2+，經(jīng)過(guò)24 h后，輪蟲(chóng)(B.koreanus)熱休克蛋白(sp90α-1和sp70)mRNA水平均顯著上調(diào)[74]。目前的研究多集中于單一重金屬對(duì)輪蟲(chóng)的毒性影響，重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)輪蟲(chóng)的毒性影響，特別是慢性毒性效應(yīng)研究方面國(guó)內(nèi)外報(bào)道相對(duì)較少[75-77]，因此，這方面的研究還有待加強(qiáng)。另外，水體中重金屬多是以低劑量狀態(tài)存在的，但長(zhǎng)期低劑量重金屬暴露對(duì)輪蟲(chóng)的毒性影響一直沒(méi)有引起足夠的重視，只在較少的一些研究中被提及。如Sarma等[78]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輪蟲(chóng)(L.quadridentata)暴露于一系列Cu2+濃度(0.31～5 μg·L-1)中，輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)與銅濃度之間呈現(xiàn)一種雙相劑量-反應(yīng)曲線，即低濃度刺激和高濃度抑制。相似的作用結(jié)果也在萼花臂尾輪蟲(chóng)暴露在低濃度Zn2+的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)[79]。近年來(lái)，污染物的低劑量興奮效應(yīng)(Hormesis)已成為生態(tài)毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)，這種現(xiàn)象在低劑量重金屬對(duì)輪蟲(chóng)的毒性作用中是否普遍存在亟需加強(qiáng)研究和證明。

3.2 紫外線(UV)輻射

臭氧層能夠吸收日光中大部分的紫外線B波段(UV-B)，臭氧層減薄會(huì)使照射到地表的UV-B輻射增多。UV-B(280～320 nm)輻射增強(qiáng)能夠引起一系列全球性變化和對(duì)生物產(chǎn)生生態(tài)學(xué)和生理學(xué)影響。Preston等[80]首先研究了UV-B輻射對(duì)毒物效應(yīng)的影響，探究UV-B輻射是否能夠提高萼花臂尾輪蟲(chóng)對(duì)五氯苯酚(PCP)或汞急性毒性的敏感性。研究表明，在一定持續(xù)時(shí)間的UV-B輻射和一定濃度的毒物作用下，UV-B輻射使得PCP和汞對(duì)B.calyciflorus的毒性提升了高達(dá)5倍，還觀察到LC50下降幅度達(dá)60%，且使B.calyciflorus的繁殖能力受到抑制。馮蕾等[81]研究發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)和壺狀臂尾輪蟲(chóng)(Brachionusurceus)2種輪蟲(chóng)都有嚴(yán)重的傷害作用，且當(dāng)輻射強(qiáng)度達(dá)一定強(qiáng)度閾值會(huì)對(duì)其產(chǎn)生急性致死作用。UV-B輻射還會(huì)對(duì)輪蟲(chóng)的種群數(shù)量、雌體抱卵率和種群增殖率都有顯著影響。高劑量UV-B輻射對(duì)輪蟲(chóng)的種群數(shù)量和雌體抱卵率有顯著的抑制作用，甚至可導(dǎo)致整個(gè)種群的滅絕[82]。此外，UV-B輻射增強(qiáng)對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的攝食也有顯著的抑制作用，隨著UV-B輻射劑量的增大，輪蟲(chóng)對(duì)多種餌料單胞藻的濾水率和攝食率都表現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)[83]。陳芝丹等[84]采用急性致死、單個(gè)體和群體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究了紫外線照射對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)、存活分布與繁殖的影響，發(fā)現(xiàn)隨著照射時(shí)間的增長(zhǎng)，輪蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力下降并產(chǎn)生急性致死效應(yīng)，死亡率與照射時(shí)間關(guān)系符合Sigmoid模型。紫外線照射下，輪蟲(chóng)的生存數(shù)據(jù)符合Weibull分布，壽命、生殖期、生殖期的平均繁殖率均顯著下降，種群增長(zhǎng)也呈下降趨勢(shì)。群體培養(yǎng)與單個(gè)體培養(yǎng)結(jié)果相似，卵密度、幼體密度和種群增長(zhǎng)率均隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降。近年來(lái)，學(xué)者們運(yùn)用紫外線輻射(UV)對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)進(jìn)行誘變處理，隨著UV輻射劑量的增加，輪蟲(chóng)的孵化率、掛卵率呈下降趨勢(shì)，個(gè)體發(fā)育大小出現(xiàn)顯著變化。目前推測(cè)有以下原因：一是UV輻射改變了輪蟲(chóng)的基因型；二是UV輻射的傷害作用使部分輪蟲(chóng)的活動(dòng)能力下降，從而使其攝食量減少，用于生殖的營(yíng)養(yǎng)減少，表現(xiàn)為產(chǎn)出較小的卵，孵化出較小的輪蟲(chóng)個(gè)體[85]。

3.3 持久性有機(jī)污染物(POPs)

持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)是指長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，具有高生物蓄積性、高致癌和難降解等特性的有機(jī)污染物，能夠在食物鏈中逐級(jí)放大，危害環(huán)境和人類健康。持久性有機(jī)污染物鄰苯二甲酸酯(phthalate acid esters，PAEs)是世界上廣泛使用的人工合成有機(jī)物，主要用作塑料增塑劑。目前PAEs引起的環(huán)境污染已受到全球性的關(guān)注。美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(USEPA)將鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等6種PAEs列為優(yōu)先控制的有毒污染物[86]。趙蘭蘭等[87]運(yùn)用輪蟲(chóng)特有的3 d種群增長(zhǎng)和4 d休眠卵產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)方法研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)和鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)均能夠顯著影響萼花臂尾輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)、混交雌體的產(chǎn)生和休眠卵產(chǎn)量。Zhang等[88]研究了全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的毒性效應(yīng)，二者是工業(yè)生產(chǎn)中常用的添加劑，也是水體中廣泛存在的持久性有機(jī)污染物全氟化合物(perfluorochemicals，PFCs)。PFCs是一種新型的持久性有機(jī)污染物，近幾年已成為國(guó)內(nèi)外生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。雖然PFCs在自然水體中的濃度很低，但是，通過(guò)食物鏈的傳遞和放大，仍然會(huì)對(duì)高等動(dòng)物包括人類造成極大的危害[88]。通過(guò)28 d的種群增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)得到PFOS和PFOA能降低輪蟲(chóng)種群密度和提高混交雌體百分率，且能夠?qū)е螺喯x(chóng)產(chǎn)體積更小的卵，這說(shuō)明二者所造成的毒性風(fēng)險(xiǎn)可以由母體傳給后代，也證明了二者對(duì)輪蟲(chóng)在個(gè)體和種群水平上均有不利影響。全氟羧酸(perfluorinated carboxylic acids，PFCAs)也是全氟化合物(PFCs)中的一類典型代表，多種PFCs可以在環(huán)境中最終轉(zhuǎn)化為PFCAs類物質(zhì)及其鹽類。2014年，Wang等[89]研究了全氟羧酸對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的急性、慢性毒性效應(yīng)，觀察了對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，實(shí)驗(yàn)得到，PFCAs(二碳～六碳)中的三氟乙酸(TFA)、五氟丙酸(PFPrA)、七氟丁酸(PFBA)、九氟戊酸(PFPeA)和十一氟己酸(PFHxA)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的24-h LC50分別為70、80、110、130和140 mg·L-1。PFCAs對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加而降低。還發(fā)現(xiàn)PFCAs能夠顯著降低萼花臂尾輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)率，提高混交率、體型和卵的大小。多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)也是一類新型的持久性有機(jī)污染物，常作為阻燃劑被廣泛應(yīng)用于塑料、紡織品、建筑材料以及家用電器等領(lǐng)域。大量PBDEs通過(guò)各種途徑最終進(jìn)入海洋，使海洋環(huán)境中的PBDEs濃度急劇上升，對(duì)海洋生物的影響也日趨加大。因此，近年來(lái)世界各國(guó)政府及學(xué)者對(duì)PBDEs污染方面的關(guān)注日益增多[90]。2015年，Sha等[90-91]針對(duì)PBDEs的毒性效應(yīng)展開(kāi)研究，選擇在海洋環(huán)境和海洋生物體內(nèi)廣泛存在的低溴代的BDE-47和高溴代的BDE-209作為脅迫因子，以褶皺臂尾輪蟲(chóng)作為受試生物，研究了2種PBDEs對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性、個(gè)體形態(tài)、運(yùn)動(dòng)行為、種群增長(zhǎng)、抗氧化酶活力、脂質(zhì)過(guò)氧化及DNA損傷的影響，系統(tǒng)研究BDE-47和BDE-209脅迫對(duì)于輪蟲(chóng)個(gè)體及種群的影響，試圖找出響應(yīng)脅迫的規(guī)律性，分析輪蟲(chóng)抗氧化防御系統(tǒng)(antioxidant system)對(duì)2種PBDEs亞致死脅迫的響應(yīng)，并從分子水平上分析了PBDEs對(duì)輪蟲(chóng)DNA的損傷，對(duì)可能的毒性作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，以期從種群、個(gè)體、生理生化、分子等不同生物組織層次和多個(gè)方面入手，評(píng)估各指標(biāo)是否可以作為PBDEs毒性評(píng)估的有效途徑和監(jiān)測(cè)手段。Wang等[92]研究了BDE-47脅迫對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的生殖毒性效應(yīng)并基于抗氧化防御系統(tǒng)的機(jī)理進(jìn)行了初步探討，BDE-47對(duì)輪蟲(chóng)脅迫24 h之后，利用透射電鏡(TEM)觀察卵巢組織，結(jié)果顯示，BDE-47脅迫后，輪蟲(chóng)的卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)受到明顯的損傷，表現(xiàn)為卵黃腺形態(tài)皺縮，核結(jié)構(gòu)畸形，卵巢組織內(nèi)部脂質(zhì)小滴數(shù)量明顯減少。卵黃腺結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致雌體輪蟲(chóng)生殖能力的下降，進(jìn)而體現(xiàn)在種群水平上；在生理生化水平上，基于ROS理論的氧化應(yīng)激作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47脅迫會(huì)導(dǎo)致褶皺臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平的升高進(jìn)而引發(fā)氧化脅迫毒性效應(yīng)，氧化脅迫干擾了輪蟲(chóng)機(jī)體的解毒作用以及與谷胱甘肽代謝相關(guān)的抗氧化酶，包括谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)的活性和還原型谷胱甘肽(gultathione-SH，GSH)的含量；Zhang等[93]針對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)氧化應(yīng)激機(jī)制對(duì)BDE-47和BDE-209誘導(dǎo)褶皺臂尾輪蟲(chóng)生殖與發(fā)育毒性效應(yīng)的作用機(jī)制進(jìn)行了探討研究，發(fā)現(xiàn)這2種PBDEs均能誘導(dǎo)褶皺臂尾輪蟲(chóng)卵巢細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升從而產(chǎn)生氧化脅迫，且與BDE-209相比，BDE-47能引發(fā)更嚴(yán)重的氧化脅迫。研究表明，當(dāng)ROS水平達(dá)到產(chǎn)生氧化脅迫的水平時(shí)，便會(huì)激活抗氧化系統(tǒng)中抗氧化酶sod和cat基因的表達(dá)以及影響Ca2+平衡和cam基因的表達(dá)水平，以期通過(guò)基于Ca2+信號(hào)通路的氧化應(yīng)激作用機(jī)制的調(diào)控以消除或減弱BDE-47和BDE-209對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)造成的氧化脅迫。

3.4 農(nóng)藥

除了以上3種脅迫條件，研究較多的還有農(nóng)藥，各種種類的農(nóng)藥也可對(duì)輪蟲(chóng)個(gè)體及種群造成不同程度的影響?，F(xiàn)在被用于農(nóng)作物生產(chǎn)中的絕大部分農(nóng)藥都是有機(jī)農(nóng)藥，其中，市場(chǎng)上流行的主要有：有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥[94-95]。有機(jī)氯農(nóng)藥具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，難以被化學(xué)降解及生物降解，對(duì)生物具有生殖毒性、內(nèi)分泌干擾毒性、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)抑制毒性等，能夠?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境及人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[94]。儲(chǔ)昭霞[96]應(yīng)用輪蟲(chóng)生態(tài)毒理學(xué)中的短期慢性毒性實(shí)驗(yàn)方法——72 h種群增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和96 h休眠卵產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)，研究了DDT、三氯殺螨醇、硫丹和林丹等4種具雌激素活性的有機(jī)氯農(nóng)藥對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)無(wú)性生殖和有性生殖的影響，結(jié)果表明，這4種有機(jī)氯農(nóng)藥能夠顯著影響輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)和混交雌體的產(chǎn)生及受精作用。對(duì)輪蟲(chóng)混交雌體產(chǎn)生的抑制作用很可能是環(huán)境雌激素效應(yīng)的表現(xiàn)，研究指出以輪蟲(chóng)的生殖來(lái)評(píng)價(jià)污染物的雌激素活性是一種簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)又靈敏的方法。有機(jī)磷農(nóng)藥的神經(jīng)系統(tǒng)的生物毒性作用機(jī)理為抑制有機(jī)體乙酰膽堿酯酶的活性，從而引起乙酰膽堿代謝紊亂。其毒性作用主要體現(xiàn)在對(duì)生物個(gè)體生理狀況與繁殖的影響，可抑制水生生物的生長(zhǎng)、攝食和呼吸過(guò)程。此外，有機(jī)磷農(nóng)藥可對(duì)生殖過(guò)程產(chǎn)生影響，抑制繁殖，減少后代數(shù)量，并對(duì)胚胎有致畸作用，同時(shí)能夠?qū)е律矬w內(nèi)分泌功能失調(diào)，影響性腺發(fā)育和激素分泌[94-95]。謝欽銘等[97]研究發(fā)現(xiàn)，褶皺臂尾輪蟲(chóng)的孵化率隨著2種有機(jī)磷農(nóng)藥敵百蟲(chóng)和久效磷濃度的增加而降低，孵化時(shí)間也隨之延長(zhǎng)，2種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的48 h半致死濃度(LC50)分別是2.8767 mg·L-1和0.0534 mg·L-1。陸正和等[98]研究得到，有機(jī)磷農(nóng)藥殺螟硫磷對(duì)輪蟲(chóng)24 h急性毒性半致死濃度為9.57 mg·L-1；慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，隨著殺螟硫磷濃度升高，輪蟲(chóng)幼體期延長(zhǎng)，生殖期縮短，壽命縮短，生殖量下降，種群增長(zhǎng)隨濃度增加而減緩；其休眠卵數(shù)量和孵化率明顯下降。呂林蘭等[99]研究了有機(jī)磷農(nóng)藥樂(lè)果對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生殖的影響，結(jié)果表明，萼花臂尾輪蟲(chóng)凈生殖率是檢測(cè)樂(lè)果毒性的最敏感指標(biāo)。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一種高效、低毒、低殘留的農(nóng)藥，它的作用機(jī)理和有機(jī)磷農(nóng)藥相似，都是抑制昆蟲(chóng)乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的活性，影響昆蟲(chóng)正常的神經(jīng)傳導(dǎo)而將其毒害。同時(shí)，氨基甲酸酯類農(nóng)藥也可抑制水生生物的生理過(guò)程和繁殖[94]。劉劍鋒[100]采用生態(tài)毒理學(xué)方法，研究了特定環(huán)境下2種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑西維因(carbaryl)和異丙威(isoprocarb)對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)生長(zhǎng)和繁殖的影響，通過(guò)單個(gè)體生命表實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)一定濃度的西維因和異丙威均能夠顯著降低(縮短)輪蟲(chóng)的平均壽命、世代時(shí)間、凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率；應(yīng)用群體培養(yǎng)法，得到二者對(duì)輪蟲(chóng)的攜卵雌體數(shù)/非攜卵雌體數(shù)、受精率、休眠卵產(chǎn)量、種群增長(zhǎng)率、混交率以及休眠卵孵化率均產(chǎn)生顯著影響，其中，休眠卵產(chǎn)量是最為敏感的指標(biāo)。可見(jiàn)，輪蟲(chóng)的生殖參數(shù)和種群參數(shù)是檢測(cè)農(nóng)藥生態(tài)毒性的重要指標(biāo)，積累的毒性數(shù)據(jù)資料可以為利用輪蟲(chóng)評(píng)價(jià)農(nóng)藥的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

4 展望(Prospect)

輪蟲(chóng)在生態(tài)毒理學(xué)研究中具有非常高的應(yīng)用價(jià)值，是水生生態(tài)毒理學(xué)新興領(lǐng)域大有前景的受試生物之一，已被國(guó)際上公認(rèn)為水生生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究所采用的無(wú)脊椎動(dòng)物中的代表生物，適用于海洋或淡水環(huán)境。預(yù)計(jì)未來(lái)輪蟲(chóng)將在生態(tài)毒理學(xué)和環(huán)境基因組學(xué)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，主要有以下幾個(gè)原因：首先，關(guān)于輪蟲(chóng)類群的遺傳信息積累，特別是關(guān)于它的基因組和轉(zhuǎn)錄特征方面的研究[4]，將大大有助于未來(lái)環(huán)境基因組學(xué)的發(fā)展。輪蟲(chóng)在環(huán)境溫和時(shí)均進(jìn)行孤雌生殖，可維持自身基因型的穩(wěn)定性，因而當(dāng)外源基因嵌入輪蟲(chóng)基因組后，便會(huì)穩(wěn)定地整合于基因組中，連續(xù)傳代保持著高度一致的基因型，外源基因便可傳代，持續(xù)表達(dá)特定的生物活性產(chǎn)物。2013年，Nature上發(fā)布了有關(guān)蛭形目輪蟲(chóng)基因組的研究報(bào)道[101]，提出蛭形輪蟲(chóng)可選擇性整合其他物種如細(xì)菌、真菌及動(dòng)植物體內(nèi)的DNA片段，這將益于其生存發(fā)展的某些基因合并到自身基因組內(nèi)為自身及后代所用。這與生物界對(duì)外源DNA片段極具抵御性的其他多細(xì)胞動(dòng)物相比，輪蟲(chóng)是整合外來(lái)基因、表達(dá)外源蛋白的極佳模式生物體；其次，由于公眾和監(jiān)管部門對(duì)于水環(huán)境污染問(wèn)題具有持續(xù)較高的關(guān)注，需要一種易培養(yǎng)的無(wú)脊椎動(dòng)物類群，而輪蟲(chóng)易培養(yǎng)且不污染水質(zhì)，對(duì)外界水環(huán)境介質(zhì)變化具有敏感性，這對(duì)于水污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和生態(tài)毒理學(xué)機(jī)理的研究十分必要；第三，輪蟲(chóng)分布廣泛，取材簡(jiǎn)便，可以建立全球多個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間輪蟲(chóng)生態(tài)毒理學(xué)的合作，這將有助于進(jìn)行更多的綜合性研究。例如，由Denekamp等[4]設(shè)計(jì)的EST(expressed sequence tags)工程所貢獻(xiàn)的B.plicatilis的基因轉(zhuǎn)錄組資源可用于未來(lái)全球范圍的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。與其他水生無(wú)脊椎動(dòng)物相比，輪蟲(chóng)具有龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)化的方法，這有利于選擇輪蟲(chóng)作為代表性的模式物種?？傊?，輪蟲(chóng)的生物學(xué)特性，使之成為水生動(dòng)物的模式生物，其體積小、繁殖力高、生命周期短、分布廣、易培養(yǎng)、具有獨(dú)特的生活史、在生態(tài)及分類學(xué)上具有代表性，這些都大大增強(qiáng)了輪蟲(chóng)在水生生態(tài)毒理學(xué)和毒理基因組學(xué)的應(yīng)用潛力[1]。此外，輪蟲(chóng)在藥品污染水環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面也有重要用途，因?yàn)槠鋵?duì)某些藥品成分的敏感性高于其他浮游生物[57]。輪蟲(chóng)在基因表達(dá)分析方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。

目前，各國(guó)專家學(xué)者對(duì)于輪蟲(chóng)開(kāi)展了一系列的生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，取得了顯著成效，但有些方面仍需要更多的研究。對(duì)于未來(lái)開(kāi)展環(huán)境污染物對(duì)輪蟲(chóng)的生態(tài)毒理效應(yīng)研究提出以下展望：(1)加強(qiáng)生態(tài)毒性效應(yīng)相關(guān)的基因分析和環(huán)境基因組研究。輪蟲(chóng)應(yīng)激基因表達(dá)的定量分析可用來(lái)評(píng)估毒理效應(yīng)，從而研究毒性作用的分子機(jī)制，這種深層次的研究在未來(lái)更有發(fā)展前景。例如，2017年，Kim等[102]從海洋輪蟲(chóng)B.plicatilis轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了28個(gè)細(xì)胞色素P450基因且分析了它們的表達(dá)，試圖闡明輪蟲(chóng)B.plicatilis對(duì)毒物的分子防御機(jī)制。目前，萼花臂尾輪蟲(chóng)具有針對(duì)不同毒物測(cè)試所獲得的信息量最大的數(shù)據(jù)庫(kù)。下一步更多的研究應(yīng)該用來(lái)比較輪蟲(chóng)種間(即遺傳或地理種群之間)和種內(nèi)對(duì)環(huán)境污染物敏感性的差異。這種差異相差的幅度需要與實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中其他條件的差異性和培養(yǎng)的不穩(wěn)定性所造成的隨機(jī)變化相比較[103-104]。(2)研究需要更多地在蛋白質(zhì)組學(xué)和生理生化水平上了解輪蟲(chóng)機(jī)體功能的應(yīng)激機(jī)制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，污染物對(duì)蛋白質(zhì)及酶等生物大分子的毒性作用機(jī)理逐漸被關(guān)注。針對(duì)不同的研究目的選取不同測(cè)試指標(biāo)，進(jìn)而在不同水平上進(jìn)行毒性評(píng)估和機(jī)理研究。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的許多生物標(biāo)志物，如氧化應(yīng)激酶、基因毒性、溶酶體改變、免疫活性以及膽堿酯酶活性等常被用于輪蟲(chóng)生態(tài)毒理學(xué)研究[105-108]，能夠提供更完整、更可靠的信息，且多指標(biāo)全面表征逐步代替單一指標(biāo)測(cè)試，以更全面準(zhǔn)確地評(píng)估污染物對(duì)輪蟲(chóng)的毒性影響，然而對(duì)于輪蟲(chóng)針對(duì)不同特定毒物的特異性生物標(biāo)志物的篩選研究還有待進(jìn)一步完善。(3)需要不斷統(tǒng)一協(xié)調(diào)和規(guī)范輪蟲(chóng)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法，使得數(shù)據(jù)信息之間便于比較[29]。目前，在輪蟲(chóng)行為測(cè)試方面仍存在爭(zhēng)議[57]，例如在亞致死劑量水平，輪蟲(chóng)的一些行為變化是否在亞致死劑量水平上可以作為檢測(cè)毒物毒性的依據(jù)，其是否能夠主動(dòng)回避毒物，如何在實(shí)驗(yàn)中避免這種影響所造成的差異，這些問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究。(4)重視污染物對(duì)輪蟲(chóng)毒性作用的過(guò)程依賴性影響。污染物對(duì)輪蟲(chóng)暴露、暴露后、再暴露的研究是一種新的綜合評(píng)價(jià)毒物毒性效應(yīng)潛在風(fēng)險(xiǎn)的方法。傳統(tǒng)的毒理學(xué)研究通常以給定的暴露時(shí)間來(lái)描述劑量-效應(yīng)關(guān)系而忽略暴露之后的潛在毒性影響。近幾年來(lái)的一些研究也表明了毒物對(duì)輪蟲(chóng)的影響具有高度的過(guò)程依賴性，在暴露過(guò)程中引起逐步的脅迫，在暴露后繼續(xù)存在潛在的脅迫[64-65]。因此，未來(lái)針對(duì)輪蟲(chóng)的生態(tài)毒理學(xué)研究應(yīng)充分考慮到毒物暴露之后和再暴露的影響。