基于土壤模式生物的納米材料毒理研究進(jìn)展

王曉科，石清清，鄧代莉，蒲生彥,3,

1. 地質(zhì)災(zāi)害防治與地質(zhì)環(huán)境保護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都理工大學(xué))，成都 610059 2. 國家環(huán)境保護(hù)水土污染協(xié)同控制與聯(lián)合修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610059 3. 香港理工大學(xué)土木及環(huán)境工程學(xué)系，香港

隨著納米科技的快速發(fā)展，越來越多的納米材料進(jìn)入到環(huán)境中，產(chǎn)生環(huán)境及生物體健康風(fēng)險(xiǎn)[1]。納米材料的潛在生物毒性，已經(jīng)成為全世界科學(xué)界、環(huán)保主義者、社會學(xué)家、倫理學(xué)家所關(guān)注的重大安全問題。2003年4月，美國學(xué)者首先研究了碳納米管的生物效應(yīng)[2]。2004年1月，Masciangioli等[3]在肯定了納米技術(shù)帶給人類生活便利的同時(shí)，也強(qiáng)調(diào)必須關(guān)注納米技術(shù)的安全性研究。隨后，越來越多的科學(xué)家及學(xué)者加入到了研究納米材料生物毒理的行列中。研究納米材料對生物、人體健康和環(huán)境的負(fù)面影響，對保證納米技術(shù)的可持續(xù)發(fā)展，不斷造福人類有重要意義。

由于土壤作為納米材料釋放到環(huán)境中主要的匯，研究納米材料對土壤生物的毒性作用也成為關(guān)注熱點(diǎn)[4]。研究納米材料的生物毒性需要選擇適合的模式生物，由于土壤生物種類眾多，選擇具有代表性的生物十分必要，而理想的模式生物又能為科研節(jié)約時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本[5]。模式生物的選擇需要注意以下幾點(diǎn)：(1)在分類學(xué)、營養(yǎng)水平及生理特征上具有代表性；(2)易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)繁殖和大量獲??；(3)生理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、遺傳學(xué)和生態(tài)學(xué)背景資料豐富；(4)對毒物具有敏感性，測試終點(diǎn)清晰且易于試驗(yàn)操作[6-7]。當(dāng)前用于納米材料生物毒性研究的典型土壤模式生物主要有秀麗隱桿線蟲[8]、蚯蚓[9-11]、跳蟲[12-14]和潮蟲[15]，都具有生理特征代表性、便于獲取與操作、繁殖周期短等普遍模式生物特性。

本文通過大量的文獻(xiàn)調(diào)研，較系統(tǒng)地歸納總結(jié)了基于幾種典型土壤模式生物的納米材料毒理研究現(xiàn)狀與進(jìn)展，提供了土壤模式生物的特性對比選擇，梳理了納米材料生物毒性機(jī)理，并對未來研究方向及重點(diǎn)做了進(jìn)一步的展望。

1 基于秀麗隱桿線蟲的納米材料毒理研究(Toxicology of nanomaterials to Caenorhabditis elegans)

秀麗隱桿線蟲(C.elegans)，簡稱秀麗線蟲，是一種被廣泛用于生態(tài)毒理學(xué)和生物毒性測試的模式生物[5]，一般為雌雄同體，是在土壤中數(shù)量豐富的多細(xì)胞生物，具有結(jié)構(gòu)簡單、小而透明、生命周期短、對環(huán)境變化敏感、行為反應(yīng)模式穩(wěn)定、遺傳背景清楚及指標(biāo)體系多樣等特點(diǎn)[16-18]。早在1965年，Sydney Brenner博士就開始培養(yǎng)線蟲作為模式生物。2002年，美國材料與試驗(yàn)協(xié)會頒布了秀麗線蟲用于土壤毒性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化指南，這肯定了線蟲可作為評價(jià)土壤生物毒性的模式生物[19]。

秀麗線蟲的評價(jià)指標(biāo)體系分為個(gè)體(動物)水平和細(xì)胞(分子)水平[5]。個(gè)體水平的指標(biāo)主要有致死率、生長發(fā)育、生殖、壽命、運(yùn)動及攝食等[20]。細(xì)胞水平的評價(jià)指標(biāo)主要包括氧化應(yīng)激、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)、DNA損傷、RNA干擾、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯等[21-22]。

工程中常用的納米材料主要分3種：碳基納米材料、量子點(diǎn)納米材料、金屬及金屬氧化物納米材料。表1梳理并總結(jié)了不同納米材料對秀麗線蟲的毒性影響。

在探索毒性機(jī)理的過程中，不同研究可能得到不完全一致的結(jié)論，可能存在某些影響毒性結(jié)果的因素，如土壤的物理化學(xué)特征(如粒度分布和有機(jī)物質(zhì))[37]及暴露環(huán)境等。有研究發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯(GO)通過DNA損傷誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，損傷性腺發(fā)育進(jìn)而導(dǎo)致秀麗線蟲生殖能力降低[27]。GO引起秀麗線蟲體內(nèi)ROS產(chǎn)生，是造成靶器官損傷的主要原因[26]。此外，某些信號通路在控制GO對生物體毒性過程中也起著關(guān)鍵作用，如神經(jīng)元ERK[38]和腸道p38 MAPK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑[39]協(xié)同作用調(diào)節(jié)對GO暴露的響應(yīng)；Wnt配體基因的功能喪失突變調(diào)節(jié)GO毒性和易位[40]；抗菌蛋白在胰島素信號通路和腸道中起作用以調(diào)節(jié)對GO的響應(yīng)[41]；Long noncoding RNAs通過調(diào)節(jié)生物學(xué)過程和信號傳導(dǎo)途徑來影響GO毒性[42]。有研究表明，存在反饋機(jī)制來加強(qiáng)MicroRNA let-7抑制保護(hù)線蟲免受多壁碳納米管(MWCNT)毒性的作用[43]。

有研究表明CdTe QDs對秀麗線蟲的毒性不僅源于Cd2+的釋放，還與NPs在腸道中[30]及其胞內(nèi)分布有關(guān)[44]。除了氧化應(yīng)激，細(xì)胞識別也影響CdTe QDs在線蟲中的神經(jīng)毒性[45]。編碼Mn-SOD的基因的過表達(dá)有效地抑制了CdTe QDs對受體介導(dǎo)(RME)運(yùn)動神經(jīng)元的發(fā)育和功能的神經(jīng)毒性作用。據(jù)相關(guān)研究顯示，CdTe QDs的氧化應(yīng)激、神經(jīng)元細(xì)胞識別和生物利用度共同作用，影響了RMEs運(yùn)動神經(jīng)元中CdTe QDs的神經(jīng)毒性[29]。

現(xiàn)在較為公認(rèn)的納米金屬及氧化物材料毒性機(jī)理有ROS的產(chǎn)生[35]、金屬離子的釋放[46]、DNA損傷與線粒體毒性[47]等。ROS產(chǎn)生與致死率、生長、繁殖、運(yùn)動行為和腸道自身熒光顯著相關(guān)，有證據(jù)表明ROS通過控制氧化應(yīng)激所需基因的表達(dá)水平變化，在誘導(dǎo)NPs毒性效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[35]。Luo等[48]發(fā)現(xiàn)Ag NPs通過引起氧化應(yīng)激增加、線粒體毒性和DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對秀麗線蟲產(chǎn)生影響。另外，熱休克蛋白、金屬硫蛋白(MT)、內(nèi)吞作用以及細(xì)胞凋亡信號等信號通路也是納米材料造成生物毒性的機(jī)制[49]。但是考慮到土壤基質(zhì)的復(fù)雜性和可用數(shù)據(jù)的缺乏，更精確的生物毒性機(jī)理目前科學(xué)界還不能輕易下定論，需要更全面深入的研究。

2 基于蚯蚓的納米材料毒理研究(Toxicology of nanomaterials to earthworms)

蚯蚓是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最常見的無脊椎土壤動物，其生物量占土壤動物總量的60%～80%，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的作用。蚯蚓有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力、對污染物敏感、體型較大、方便檢測體內(nèi)粒子分布、培養(yǎng)方便、操作簡單等特點(diǎn)[50]，被廣泛應(yīng)用于污染物生物毒性測試和土壤污染風(fēng)險(xiǎn)評估，被認(rèn)為是理想的土壤污染指示生物[9]。蚯蚓生態(tài)毒性測試的標(biāo)準(zhǔn)方法已經(jīng)由國際標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合會(International Organization for Standardization, ISO)制定，實(shí)驗(yàn)室開展蚯蚓生物富集研究的標(biāo)準(zhǔn)草案也已經(jīng)由美國測試與材料學(xué)會發(fā)布[10]。

納米材料對蚯蚓的毒性研究主要從3個(gè)層次展開：種群水平、個(gè)體水平、微觀水平[11]。個(gè)體水平研究包括食物富集作用、存活及行為反應(yīng)、發(fā)育繁殖效應(yīng)。目前常用的蚯蚓微觀評價(jià)指標(biāo)有：DNA的損傷、酶活性、金屬硫蛋白和氧化應(yīng)激水平等[51]。表2梳理并總結(jié)了不同納米材料對蚯蚓的毒性影響。

納米材料對蚯蚓的毒性機(jī)理包括影響酶活性[57]、誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生[60]、DNA損傷[60]、消耗能量儲備[61]等。不同測試指標(biāo)的敏感度也不盡相同，有研究表明，蚯蚓對污染物的回避行為可能比更成熟的生物參數(shù)(如死亡率、生長或繁殖)更敏感[60]，具有反應(yīng)快速、靈敏度高和重現(xiàn)性良好等特點(diǎn)。利用蚯蚓回避行為評價(jià)土壤環(huán)境質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)方法(ISO，2005)的發(fā)布，表示蚯蚓作為模式生物在污染土壤生態(tài)評價(jià)方面具有廣闊前景[52]。

3 基于其他模式生物的納米材料毒理研究(Toxicology of nanomaterials to other model creature)

3.1 跳蟲

跳蟲(springtails或Collembolans)又稱彈尾蟲、腹管蟲、粘管蟲等，是彈尾綱動物的俗稱,是分布廣泛的一種無脊椎節(jié)肢動物，生活在潮濕的土壤環(huán)境中，其種類豐富，數(shù)量眾多，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演了重要角色[12]。常用的跳蟲主要有Folsomiacandida和Orchesellacincta等，其中跳蟲Folsomiacandida應(yīng)用最廣泛，它生長周期短，易于實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)，對土壤污染較為敏感。Folsomiacandida生態(tài)毒性測試方法(ISO，1999)為應(yīng)用跳蟲對污染土壤進(jìn)行生態(tài)毒性評價(jià)提供了基礎(chǔ)依據(jù)[62]。

Tourinho等[63]研究發(fā)現(xiàn)CeO2NPs對Folsomiacandida的存活和繁殖沒有不利影響。在高濃度6 400 mg·kg-1下，ZnO NPs不影響跳蟲的存活、繁殖，而低濃度時(shí)有輕微影響，30 nm和200 nm ZnO的毒性幾乎沒有差異[64]，說明粒徑大小并沒有明顯影響生物毒性。由ZnO NPs釋放的鋅離子可能是影響毒性大小的主要因素。ZnO NPs對生殖的影響隨著pH的增加而降低，EC50值隨著pH值的增加而增加[64]。跳蟲暴露在濃度高達(dá)673 mg·kg-1的Ag NPs下28 d后時(shí)仍然沒有觀察到跳蟲的生存和繁殖異常，但是溶解的銀離子會被跳蟲吸收而造成一定影響[65]。納米銀的潛在毒性是否由釋放的游離銀離子引起，還需要更多的研究。

3.2 潮蟲

潮蟲(Porcellio)俗稱鼠婦、木虱或西瓜蟲等，屬于甲殼動物亞門軟甲綱等足目潮蟲亞目，是唯一能完全適應(yīng)陸地生活的等足類動物，其分布廣泛，主要活動于地表凋落物層中，是土壤有機(jī)體的重要分解者。其數(shù)量巨大，種類繁多，對環(huán)境敏感性好，也被用于評價(jià)污染土壤的毒性測試[15]。

Novak等[66]通過常規(guī)的毒性測試如攝食率、體重等，評估攝入濃度為1 000、2 000 mg·kg-1納米TiO2對潮蟲的短期(3 d和7 d)和長期(14 d和28 d)變化和死亡率的影響。在飲食暴露于納米TiO23、7、14或28 d沒有觀察到嚴(yán)重的毒性作用，即沒有死亡，體重?zé)o明顯變化。Drobne等[67]也發(fā)現(xiàn)在1 000 mg·kg-1和3 000 mg·kg-1納米TiO2暴露時(shí)，潮蟲的存活率、攝食率和體重沒有變化。但是在微觀指標(biāo)方面卻有不一樣的發(fā)現(xiàn)，Jemec等[68]研究發(fā)現(xiàn)攝食納米TiO2對潮蟲消化腺體中過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等抗氧化酶的活性以劑量依賴性方式影響，高濃度和低濃度時(shí)CAT和GST活性有所降低，但是中等濃度(1～1 000 mg·kg-1)時(shí)沒有導(dǎo)致酶活性的顯著變化。暴露于較低濃度納米顆粒的潮蟲，其消化細(xì)胞膜嚴(yán)重不穩(wěn)定。研究表明細(xì)胞膜強(qiáng)烈的不穩(wěn)定性是零星存在的[64]，需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)納米顆粒的這種零星的毒性效應(yīng)。

4 結(jié)語與展望(Conclusion and prospect)

目前基于土壤模式生物的納米毒理研究還處于起步階段，理論基礎(chǔ)比較缺乏，研究數(shù)據(jù)也不全面，研究的深度和廣度都有待提高。近年來的研究有從單一污染物向復(fù)合污染物，靜態(tài)研究向動態(tài)研究轉(zhuǎn)變的趨勢，但是也多側(cè)重于直接毒性，而對于土壤中生物物種之間的相互作用關(guān)注較少，因此在種群或群落水平研究有很大差距。依據(jù)模式生物選擇原則，重點(diǎn)考慮生命周期、暴露方式和毒理學(xué)意義，不斷完善土壤模式生物體系，對評估納米毒性和探究納米毒性機(jī)理至關(guān)重要，也對建立相關(guān)的環(huán)境基準(zhǔn)有重要意義。而由于生物多樣性和地理分布差異，不同地區(qū)的物種敏感度分布也存在差異，因此，對于不同國家建立本土物種的毒性測試數(shù)據(jù)庫也十分必要。秀麗線蟲、蚯蚓和跳蟲等是目前納米毒理學(xué)研究中應(yīng)用最多的模式生物，與此同時(shí)，其他良好的模式生物也要加快探索，以便更全面、準(zhǔn)確地評價(jià)納米生物毒性和探索毒性機(jī)理。

隨著納米材料生物毒理的逐步研究深入，其對土壤模式生物的研究應(yīng)在以下幾個(gè)方面加以發(fā)展和完善：(1)依據(jù)模式生物選擇原則進(jìn)一步篩選合適的理想模式生物；(2)建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法，建立并完善統(tǒng)一的在線共享數(shù)據(jù)庫；(3)深入探索從個(gè)體水平、細(xì)胞水平到分子水平的毒性機(jī)理，應(yīng)用基因技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)探索深層次毒性機(jī)理；(4)將體內(nèi)和體外研究結(jié)合起來，重點(diǎn)關(guān)注生物種群間相互作用，探索納米材料對微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能的影響；(5)開展對影響納米材料生物毒性的有關(guān)因素的研究，重點(diǎn)研究土壤性質(zhì)在納米材料對模式生物毒性中的作用。