轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5對大型蚤(Daphnia magna)的生態(tài)毒性研究

張莉，韓娟, 劉標(biāo),*

1. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，環(huán)境保護(hù)生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042 2. 農(nóng)業(yè)部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081

玉米作為重要的糧食和飼料作物，在中國乃至世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上都占據(jù)重要地位。玉米原料及其加工過程的副產(chǎn)品，如玉米油、玉米蛋白粉、玉米胚芽粕等是很多水生動(dòng)物重要飼料來源[1-3]，為水生動(dòng)物生長提供營養(yǎng)和能量。

玉米在其巨大需求的同時(shí)，也面臨著蟲害、雜草等諸多減產(chǎn)因素。轉(zhuǎn)基因玉米的問世緩解了玉米供不應(yīng)求的突出矛盾，為玉米糧食安全做出巨大貢獻(xiàn)。截止到2007年，國外至少有40種轉(zhuǎn)基因玉米通過安全評估并批準(zhǔn)釋放，用于食品和飼料的原材料[4]，自2010年始，我國也批準(zhǔn)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米用于飼料加工。

轉(zhuǎn)基因玉米在降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品品質(zhì)方面，顯示出獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢和全新的開發(fā)前景，與此同時(shí)，其對環(huán)境和人類健康造成的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。由于轉(zhuǎn)入的外源基因并非作物本身基因庫的基因，外源基因的插入引發(fā)的非預(yù)期效應(yīng)可能對宿主細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響，甚至產(chǎn)生一些新的代謝產(chǎn)物[5-6]，進(jìn)而引發(fā)一些潛在或尚不可預(yù)見的后果，因此使用動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)來評價(jià)其安全性非常必要[7]?，F(xiàn)有的關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米飼喂試驗(yàn)主要集中于一些哺乳動(dòng)物上[8-10]，而動(dòng)物飼喂試驗(yàn)往往存在著試驗(yàn)周期長、成本高等諸多不足[11]，且大部分飼喂試驗(yàn)時(shí)間選擇的是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命周期的某一階段[12]，這個(gè)時(shí)間段相比動(dòng)物壽命來說都比較短，而實(shí)際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品或飼料對動(dòng)物的影響可能是以低濃度長期作用的方式進(jìn)行的[13]。另外，幼齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可能對受試物更為敏感，因此使用動(dòng)物飼喂試驗(yàn)對轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品進(jìn)行安全評價(jià)時(shí)有必要同時(shí)關(guān)注試驗(yàn)動(dòng)物的幼齡期和成齡期2個(gè)時(shí)間段[14]。

一些研究者發(fā)現(xiàn)，包括轉(zhuǎn)基因玉米在內(nèi)的一些轉(zhuǎn)基因作物在自然栽培過程中，作物花粉、根系分泌物、碎屑物等會(huì)隨環(huán)境變化進(jìn)入農(nóng)田周圍的自然水域(如池塘、濕地、人工/天然溪流等)[15-16]，進(jìn)而使鄰近水域中的水生生物接觸到外源蛋白。Douville等[17-18]在對轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米田周邊水域的表面水、沉積物以及河蚌組織內(nèi)檢測到cry1Ab基因存在，由此可見轉(zhuǎn)基因玉米對水生生態(tài)系統(tǒng)造成的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。

大型蚤(Daphniamagna)，屬于枝角類水生生物，其生活周期短、繁殖快、易于實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)且對污染物敏感[19-20]，其生存和繁殖能力試驗(yàn)通常被視為水生環(huán)境監(jiān)測的常規(guī)方法[21]。轉(zhuǎn)基因作物成功培育后，許多研究者將大型蚤應(yīng)用于外源蛋白[22-24]、花粉[25]、飼料[13,26]等安全性評價(jià)中，這些研究為以大型蚤為試驗(yàn)動(dòng)物測試轉(zhuǎn)基因材料安全性提供了方法參考。水產(chǎn)養(yǎng)殖越來越多地使用轉(zhuǎn)基因材料也越發(fā)突出了研究和評價(jià)轉(zhuǎn)基因材料飼料安全性的重要性[13]。

中國和歐盟等國家和地區(qū)都要求對新開發(fā)的轉(zhuǎn)基因作物品種進(jìn)行亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)，抗蟲和耐除草劑玉米C0030.3.5作為新的轉(zhuǎn)化體，其安全性仍需要根據(jù)個(gè)案評估的原則進(jìn)行食用安全性評估，且C0030.3.5同時(shí)具有抗蟲和和耐除草劑2種特性，目前同時(shí)表達(dá)2種外源蛋白的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對水生生物的食用安全性的評價(jià)還鮮見報(bào)道。本研究以C0030.3.5玉米為唯一食物來源飼喂大型蚤，在大型蚤生命周期內(nèi)評價(jià)C0030.3.5對其生長和繁殖的影響，以期為評估轉(zhuǎn)基因玉米作為飼料的安全性提供科學(xué)參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司提供的抗蟲和耐除草劑雙價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米C0030.3.5(外源基因cry1Ab和epsps)籽粒及其親本DBN318玉米籽粒。玉米籽粒使用TC-10型超音速氣流粉碎分級(jí)機(jī)進(jìn)行低溫粉碎，粉碎后的玉米粉粒徑10～15 μm，符合大型蚤對食物粒徑的需求[11,27]。采用隨機(jī)抽樣方法對玉米粉進(jìn)行營養(yǎng)成分測定(n=3)，經(jīng)測定，2種玉米粉在蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉以及主要礦物質(zhì)元素上含量一致(P>0.05)，具體營養(yǎng)成分見表1。采用玉米Cry1Ab和EPSPS檢測試劑盒(Envirologix)對隨機(jī)選取的10份C0030.3.5和DBN318玉米粉進(jìn)行Cry1Ab和EPSPS蛋白含量測定，結(jié)果顯示C0030.3.5玉米粉2種蛋白的表達(dá)量分別為1.49(±0.33 SD) μg·g-1和35.42(±0.89 SD) μg·g-1，DBN318檢測結(jié)果均顯示陰性。

1.2 供試大型蚤

本研究選用的大型蚤引自環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，在本實(shí)驗(yàn)室長期培養(yǎng)馴化，選擇培養(yǎng)3代以上遺傳背景相同、行動(dòng)活潑的6～24 h的孤雌生殖的幼蚤作為實(shí)驗(yàn)蚤。為測試受試大型蚤的敏感性和實(shí)驗(yàn)操作步驟的統(tǒng)一性，以重鉻酸鉀K2Cr2O7為敏感性測定毒物，按照GB/T13266—1991方法[28]測定大型蚤的敏感性。經(jīng)測定，20 ℃時(shí)重鉻酸鉀的24 h半數(shù)效應(yīng)濃度(24 h-EC50)為0.922 mg·L-1，符合大型蚤的敏感性要求(0.9～1.7 mg·L-1)，可以作為標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)置小球藻(Chlorellavulgaris)組、DBN318玉米粉組和C0030.3.5玉米粉組3個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10頭大型蚤。實(shí)驗(yàn)選用100 mL燒杯，每杯盛放80 mL M4培養(yǎng)溶液[29]，并隨機(jī)放置1頭幼蚤。試驗(yàn)過程中，小球藻組每日飼喂一次濃縮藻液，喂食終密度約為5×105個(gè)·mL-1，DBN318玉米粉組和C0030.3.5玉米粉飼喂1.5 g·L-1的相應(yīng)的玉米粉 1 mL。每天定時(shí)觀察大型蚤的生長繁殖情況，同時(shí)記錄各處理組大型蚤存活情況，統(tǒng)計(jì)大型蚤存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中每3天更換一次培養(yǎng)液，每次換培養(yǎng)液的同時(shí)，測定大型蚤的體長(從頭部到殼刺基部)。當(dāng)大型蚤開始繁殖后，記錄首次繁殖時(shí)間、實(shí)驗(yàn)期間累積產(chǎn)幼蚤總數(shù)，并使用前端處理過的3 mL巴氏吸管將新生幼蚤移出。試驗(yàn)在溫度(22±1) ℃，光強(qiáng)為60 μmol·m-2·s-1，光暗比為16 h: 8 h的恒溫培養(yǎng)室(Binder，KBF720，德國)中持續(xù)28 d。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，Sigmaplot 10.0繪圖。使用SPSS 17.0軟件ANOVA程序進(jìn)行單因子方差分析，Tukey’s test 進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)上檢驗(yàn)的顯著性水準(zhǔn)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 綠藻組大型蚤

實(shí)驗(yàn)中小球藻組大型蚤作為空白對照驗(yàn)證試驗(yàn)過程的有效性[28]，至21 d時(shí)小球藻組存活率為80%，新生幼蚤98頭，試驗(yàn)期間未有卵鞍出現(xiàn)，符合大型蚤生長和繁殖試驗(yàn)的需求[28]。小球藻組大型蚤存活率、體長情況如圖1、圖2所示，繁殖參數(shù)列入表2。

2.2 存活率

圖1顯示的是小球藻組、親本玉米DBN318組和抗蟲耐除草劑玉米C0030.3.5組實(shí)驗(yàn)蚤28 d存活率變化情況(圖 1)。實(shí)驗(yàn)過程中，2個(gè)玉米粉組試驗(yàn)蚤隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加均有一定的死亡。方差分析顯示C0030.3.5組大型蚤和親本DBN318組大型蚤存活率沒有顯著性差異(P>0.05)。

表1 C0030.3.5與DBN318玉米營養(yǎng)成分分析Table 1 Comparison of main components in maize seeds between C0030.3.5 and its parental line DBN318

注: 表內(nèi)數(shù)據(jù)均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)，同一行數(shù)據(jù)右上角字母不同，表示差異顯著(P<0.05，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))；字母相同表示差異不顯著 (P>0.05)。Note: The values in the table are the mean ± standard deviation (n=3). Values in the same row with different superscripts represent significant difference (P< 0.05,t-test); values in the same row with same superscripts are not significantly different (P>0.05).

2.3 體長

不同食物條件下大型蚤的體長表現(xiàn)不同(圖2)。小球藻組試驗(yàn)蚤體長在1～10 d內(nèi)增加明顯，11 d后緩慢增長，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(28 d)小球藻組平均體長3.79 mm。對于DBN318和C0030.3.5玉米粉組試驗(yàn)蚤，28 d試驗(yàn)期內(nèi)，2個(gè)玉米粉組試驗(yàn)蚤體長在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)增長模式大體一致，第3～28天期間，C0030.3.5玉米粉組大型蚤體長與親本玉米粉組的相比，沒有顯著性差異(P>0.05)，至28 d時(shí)，DBN318和C0030.3.5玉米粉組大型蚤平均體長分別為2.54 mm和2.65 mm，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示兩者無顯著性差異(P>0.05)。各組大型蚤體長隨時(shí)間變化情況見圖2。

2.4 繁殖

不同食物飼喂處理對大型蚤的繁殖指標(biāo)影響見表2。相對于小球藻組，2個(gè)玉米粉組大型蚤均表現(xiàn)出一些繁殖劣勢，如首次繁殖時(shí)間滯后、首次產(chǎn)幼蚤數(shù)較少、累積新生大型蚤總數(shù)較少，這些參數(shù)與小球藻組有顯著性差異，說明僅飼喂玉米粉食物會(huì)對大型蚤的生殖量產(chǎn)生一定影響。不過，抗蟲耐除草劑玉米C0030.3.5和親本玉米DBN318玉米米粉組大型蚤在首次幼蚤繁殖時(shí)間、首次產(chǎn)幼蚤數(shù)及新生小水蚤總數(shù)上均沒有顯著性差異(P>0.05)。

3 討論(Discussion)

隨著生產(chǎn)加工中越來越廣泛地使用轉(zhuǎn)基因作物作為飼料原料，對轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品可能存在的安全問題進(jìn)行動(dòng)物飼喂試驗(yàn)評估已是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評價(jià)的重要內(nèi)容。本研究以抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米C0030.3.5為食物來源飼喂大型蚤，評價(jià)其對大型蚤安全性。研究表明與飼喂DBN318親本玉米粉的大型蚤相比，C0030.3.5玉米粉組大型蚤在體長、存活率及繁殖等方面與常規(guī)玉米沒有顯著性差異，說明C0030.3.5轉(zhuǎn)基因玉米粉并沒有引起大型蚤在生長和繁殖方面的不良反應(yīng)，攝入轉(zhuǎn)基因玉米粉并不會(huì)對大型蚤產(chǎn)生不利影響。

在使用C0030.3.5玉米粉和其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅BN318玉米粉飼喂大型蚤28 d試驗(yàn)過程中，C0030.3.5轉(zhuǎn)基因玉米粉并沒有引起大型蚤在生長和繁殖方面的不良反應(yīng)。與我們研究結(jié)果不同的是，B?hn等[11]使用抗蟲MON810玉米種子、Cuhra等[13]使用抗農(nóng)達(dá)大豆粉(Roundup-ready soyben)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因成分對大型蚤有一定的副作用。Holderbaum等[30]的研究也表明，食用MON810玉米葉子對大型蚤有顯著的慢性不良影響，研究者指出，食用MON810玉米葉的大型蚤相比于對照組表現(xiàn)為體型的減小，生活史中后期階段的累積繁殖速率降低，最顯著的差異為卵鞍生產(chǎn)增加了3.5倍(卵鞍是對脅迫的一種響應(yīng))，具有明顯的生物學(xué)效應(yīng)。在Holderbaum等[30]的研究中，研究者使用的MON810玉米葉Cry1Ab蛋白表達(dá)量高達(dá)2 530 ng·g-1，Bt蛋白濃度是C0030.3.5玉米粉的2倍，這或許表明大型蚤生活史的差異與食物材料和外源蛋白的濃度有一定關(guān)聯(lián)。

圖1 飼喂不同飼料大型蚤的存活率變化Fig. 1 Survival rate of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris, DBN318 maize and C0030.3.5 transgenic maize

圖2 飼喂不同飼料大型蚤體長變化Fig. 2 Mean body sizes of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris, DBN318 maize and C0030.3.5 transgenic maize

表2 飼喂不同飼料大型蚤的繁殖指標(biāo)Table 2 Fecundity of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris, DBN318 maize and C0030.3.5 transgenic maize

注: 表內(nèi)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，同一列內(nèi)具有相同字母表示差異不顯著，不同字母差異顯著(Tukey’s test,P<0.05)。Note: Data presented are Means ± SD, means with different superscripts in the same line are significantly different (Tukey’s test,P<0.05).

一些研究表明，食物品質(zhì)較低時(shí)可能對D.magna產(chǎn)生多方面影響，如生長速度較小[31]、首次繁殖推遲[32]以及繁殖力下降[33]等。在本研究中，與小球藻組相比，2個(gè)玉米粉組均出現(xiàn)了體長較小、首次繁殖滯后以及總繁殖量降低的情況，由于這些現(xiàn)象在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米粉組均有出現(xiàn)，且二者在這些指標(biāo)上并沒有顯著性差異，我們推斷攝入轉(zhuǎn)基因玉米粉并不是大型蚤適應(yīng)性變化的原因，小球藻組和玉米粉組在生長和繁殖上的差異可能是由于食物品質(zhì)不同造成的。對大型蚤來說，玉米粉可能并不是一種高品質(zhì)高營養(yǎng)的食物，單純的玉米粉可能會(huì)導(dǎo)致大型蚤生長出現(xiàn)營養(yǎng)不良、食物利用效率低或者其他不利情況。雖然玉米粉組大型蚤生長和繁殖的表現(xiàn)在某種程度上是可預(yù)料的，但實(shí)驗(yàn)中沒有在玉米粉中添加綠藻等天然食物來提高大型蚤的生存活力，這是因?yàn)橹穷悇?dòng)物對食物的攝入主要是基于食物粒徑而不是氣味或硬度[34-35]，混合其他食物(如綠藻)后，大型蚤可能會(huì)同時(shí)攝入綠藻和玉米粉，從而影響對玉米粉的取食，另外使用玉米粉作為大型蚤生長繁殖的唯一能量來源，可使大型蚤最大限度的接觸、暴露于C0030.3.5轉(zhuǎn)基因玉米中。

C0030.3.5作為新近研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米品種，同時(shí)表達(dá)抗蟲和耐除草劑2種外源蛋白，而目前評估表達(dá)多種外源蛋白的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的方法還在探索之中，鑒于一些僅表達(dá)抗蟲性狀或耐除草劑性狀的轉(zhuǎn)基因作物對大型蚤及某些水生生物具有一定影響[11, 13, 36-38]，因此在對表達(dá)多種外源蛋白的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性評估過程中，同時(shí)探究外源蛋白是否單獨(dú)或者同時(shí)對一些非靶標(biāo)生物產(chǎn)生影響，外源蛋白之間、外源蛋白與玉米內(nèi)源蛋白質(zhì)之間是否存在一些相互作用，有助于得出更為準(zhǔn)確評估結(jié)果，另外，我們評價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米粉對大型蚤的亞慢性毒性試驗(yàn)僅在大型蚤一個(gè)世代內(nèi)進(jìn)行，一代之內(nèi)有些不良效應(yīng)或某些基因水平的改變可能尚不明顯，增加傳代次數(shù)往往可以把一些微小變化所產(chǎn)生的影響表現(xiàn)出來，因此今后可進(jìn)行多代繁殖試驗(yàn)，以達(dá)到更為全面的評估結(jié)果。