氯化鉀和氯化銨對葛仙米的生理影響

劉樹文， 楊川黔

(貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550018)

葛仙米(NostocsphaeroidesKützing.)生長于水稻田中，別稱“天仙米”“天仙菜”“田木耳”，是一種藥、食兩用固氮藍(lán)藻?！侗静菥V目》記載，自東晉開始，葛仙米就被作為一種美食和中草藥成分，至今已有1 500多年的歷史[1]。其蛋白質(zhì)含量較高，含有豐富的人體必需的各種氨基酸、脂肪酸、維生素以及礦質(zhì)元素，并且含有具有多種藥用價值的各種多糖、色素等，還含有超氧化物歧化酶等生理活性物質(zhì)[2-3]。據(jù)《本草綱目》《全國中草藥匯編》以及《本草綱目拾遺》等記載，葛仙米性寒、味淡，具有明目益氣、解熱清膈、消除疲勞、久食延年，能治療目赤紅腫、夜盲癥、脫肛、燙傷，兼具美容護(hù)膚之功效，具有很高的藥用和保健價值[4]。葛仙米在保健食品、食品添加劑、動物飼料、醫(yī)藥、美容以及精細(xì)化加工品等領(lǐng)域也具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[4-5]。

葛仙米作為我國傳統(tǒng)出口的珍貴產(chǎn)品，同時在國內(nèi)市場也占有舉足輕重的地位。葛仙米市場供不應(yīng)求，價格昂貴，只有少數(shù)人能品嘗到這種珍稀的食用藍(lán)藻[6]。野生葛仙米在世界范圍內(nèi)分布稀少，主要分布在我國湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)周圍的水稻田中，非洲有少量分布，也曾在陜西、湖北、廣西、廣東等省(區(qū))有發(fā)現(xiàn)[1]。葛仙米的生長期為每年的11月份到第二年的5月份[1，7]。野生葛仙米產(chǎn)量甚微，大概每年 7.5 kg/hm2左右[7]。湖北省鶴峰縣適于葛仙米生長的水稻田有 796 hm2，但最大年產(chǎn)量已由25年前的25 t銳減至0.5 t[1]。為了保護(hù)野生葛仙米資源并使其得到合理的開發(fā)利用，關(guān)于葛仙米的生理生態(tài)學(xué)以及野生葛仙米的人工培養(yǎng)方面的研究引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。陳珍研究了除草劑、殺蟲劑等農(nóng)藥對葛仙米的毒害效應(yīng)，農(nóng)藥的使用已被認(rèn)為是葛仙米減產(chǎn)的重要原因之一[7]。

NH4Cl和KCl是水稻田中廣泛施用的2種含氯氮肥和鉀肥。李云廣等研究了高濃度的NaCl對葛仙米生理生化特性的影響[8]。陳珍等研究表明1 mmol/L NH4Cl抑制了葛仙米的光合作用和呼吸作用速率[7，9]。本試驗將比較研究 1 mmol/L NH4Cl和1 mmol/L KCl 2種含氯化肥對葛仙米的生理生化特性的影響，為野生葛仙米資源的生態(tài)保護(hù)提供理論依據(jù)，為葛仙米保護(hù)區(qū)稻田的合理施肥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 葛仙米的培養(yǎng)

葛仙米采自貴州省岑鞏縣凱本鄉(xiāng)沈家灣村的水稻田中，在實(shí)驗室內(nèi)制作得到人工培養(yǎng)的無雜藻和雜菌的葛仙米藻種。配制BG110培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min。藻種經(jīng)過勻漿之后，分別接種到9個經(jīng)高壓滅菌的500 mL錐形瓶中，加入 450 mL BG110培養(yǎng)基。分成3組，每組3個重復(fù)。1組用BG110培養(yǎng)基、1組用含1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基、1組用含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基培養(yǎng)葛仙米。培養(yǎng)溫度為25 ℃，用30 W日光燈提供光照，光照度通過照度計測定，培養(yǎng)光照度為1 500 lx。用空氣泵通入用0.22 μm濾膜過濾的無菌空氣，通氣量為300 mL/min，經(jīng)過8 d光照培養(yǎng)，取藻樣測定各項生理指標(biāo)。

1.2 比生長速率的測定

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 d，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8 d后，從9個錐形瓶中各取藻液10 mL，離心30 min，去上清液，加3 mL 95%乙醇，振蕩，放入4 ℃冰箱中24 h。4 000 r/min離心30 min后，取上清液，用分光光度計測定D665 nm和D649 nm。

葉綠素a(chlorophyll a，簡稱Chl a)含量計算公式[10]：

Chla(mg/L)=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm。

(1)

比生長速率的計算公式[7]：

μ=(lnX1-lnX2)/(T2-T1)。

(2)

式中：X1、X2分別是T1(0 d)、T2(8 d)的葉綠素a含量。

1.3 各種光合色素含量的測定

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d，分別從9個培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加3 mL 95%乙醇，4 ℃冰箱中放置24 h后 4 000 r/min 離心30 min，取上清液，用分光光度計在波長665、649、470 nm下測定吸光度D[16]。葉綠素b和類胡蘿卜素(carotenoid，簡稱Car)含量依據(jù)下列公式計算：

Chlb(mg/L)=24.96×D649 nm-7.32×D665 nm；

(3)

Car(mg/L)=1 000×D470 nm-2.05×Chla-114.8×Chlb。

(4)

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d，分別從9個培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次后4 000 r/min離心30 min。取上清液，用分光光度計測定上清液在波長562、615、652 nm下測定吸光度D。再計算出藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱PC)、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱PE)的含量。根據(jù)Siegelman & Kycia計算[11]：

PC(mg/mL)=(D615 nm-0.474×D652 nm)/5.34；

(5)

APC(mg/mL)=(D652 nm-0.208×D615 nm)/5.09；

(6)

PE(mg/mL)=(D562 nm-2.41×PC-0.849×APC)/9.62。

(7)

1.4 蛋白質(zhì)含量的測定(考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[10])

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d，從9個培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。提取得到的葛仙米蛋白溶液通過考馬斯亮藍(lán)G-250法測定。

1.5 可溶性糖含量的測定(蒽酮法[10])

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d，從9個培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加4 mL蒸餾水，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。提取得到的葛仙米可溶性糖溶液通過蒽酮法測定。

1.6 丙二醛含量的測定(硫代巴比妥酸法)

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d，從9個培養(yǎng)瓶中各取藻液20 mL，4 000 r/min離心30 min，去上清液，加5% TCA 5 mL，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min后，分別取上清液2 mL放入相應(yīng)帶蓋的試管中，再向每支試管中加0.67% TBA 2 mL，混合后沸水浴30 min，冷卻后 4 000 r/min 離心30 min后，取上清液，用分光光度計在波長450、532、600 nm下測定吸光度D，按公式C(μmol/L)=6.45(D532 nm-D600 nm)-0.56D450 nm計算出MDA濃度。樣品MDA含量(μmol/mg葉綠素)=C(μmol/L)×5/20/葉綠素濃度(mg/L)。

1.7 統(tǒng)計分析

利用軟件STATISTICA?7.0(StatSoft Inc，Tulsa，OK，USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s顯著性檢驗(HSD)用來檢測不同處理間的顯著性水平。正態(tài)分布和方差同質(zhì)性分析分別根據(jù)Lilliefors檢驗和Levene檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 KCl和NH4Cl對葛仙米生長的影響

BG110培養(yǎng)基、含1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基3種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)葛仙米的生長曲線見圖1。葛仙米分別在BG110培養(yǎng)基、含1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d后，以葉綠素含量表示的生物量分別增加到0 d的4.34、3.95倍；而在含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d后葛仙米的生物量降低到0 d的0.31倍。4 d以后1 mmol/L NH4Cl對葛仙米的生長有明顯的抑制作用，而1 mmol/L KCl對葛仙米的生長沒有明顯影響。

葛仙米分別在用BG110培養(yǎng)基、含1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基、含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d后葛仙米的比生長速率見表1。在1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)的葛仙米的比生長速率略低于BG110培養(yǎng)下葛仙米的比生長速率，但兩者之間無顯著差異(P>0.05)。但1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基中生長的葛仙米的比生長速率為負(fù)值，與BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)的葛仙米的比生長速率相比降低了168.4%(P<0.05)。

表1 3種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)8 d后葛仙米的比生長速率

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著。下表同。

2.2 KCl和NH4Cl對葛仙米光合色素含量的影響

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d后，葛仙米的3種藻膽蛋白(藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白)含量見表2。與BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米相比，1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米的藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了23.7%、16.1%和21.5%，但無顯著差異(P>0.05)；1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米的藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了71.6%、74.6%和71.1%，且有顯著差異(P<0.05)。

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d后，葛仙米的葉綠素a、類胡蘿卜素2種光合色素含量見表3。與BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米相比，1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米的藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了3.4%、5.8%，但無顯著差異(P>0.05)；1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米的藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白3種藻膽蛋白分別降低了72.2%、52.8%，且有顯著差異(P<0.05)。

2.3 KCl和NH4Cl對葛仙米可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖2可見，溶液中可溶性蛋白質(zhì)含量(y)與考馬斯亮藍(lán)染色后的可溶性蛋白質(zhì)溶液在595 nm波長下的吸光度(x)之間的直線方程為：y=0.002x+0.006(r2=0.997)。葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d后，葛仙米的可溶性蛋白質(zhì)含量見圖3。與BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米相比，1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基、1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米的可溶性蛋白質(zhì)含量分別降低了 5.7%(P>0.05)和53.0%(P<0.05)。

表2 3種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6 d后葛仙米3種藻膽蛋白含量

表3 3種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6 d后葛仙米葉綠素a和類胡蘿卜素含量

2.4 KCl和NH4Cl對葛仙米可溶性糖含量的影響

根據(jù)圖4，溶液中可溶性糖含量(y)與蒽酮試劑染色后的可溶性糖溶液在620 nm波長下的吸光度(x)之間的直線方程為：y=1.511 6x-0.022(r2=0.997)。葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d后，葛仙米的可溶性糖含量見圖5。與BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米相比， 1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基、1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米的可溶性糖含量分別降低了3.9%(P>0.05)和45.7%(P<0.05)。

2.5 KCl和NH4Cl對葛仙米丙二醛含量的影響

葛仙米在BG110、含1 mmol/L KCl的BG110以及含 1 mmol/L NH4Cl的BG1103種不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d后，葛仙米的丙二醛含量見圖6。BG110培養(yǎng)基、含1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)葛仙米的丙二醛含量較低，且兩者之間無顯著差異(P>0.05)。含1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基培養(yǎng)下葛仙米的丙二醛含量大幅度升高，分別升高到前兩者的21.7、22.0倍(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本試驗比較研究了1 mmol/L KCl和NH4Cl 2種含氯化肥對葛仙米生理生化特性的影響。添加1 mmol/L NH4Cl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)的葛仙米，以葉綠素a含量表示的生物量、比生長速率以及各種光合色素、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量大幅度下降(P<0.05)；添加1 mmol/L KCl的BG110培養(yǎng)基中培養(yǎng)的葛仙米，上述各項生理指標(biāo)略微降低但無顯著差異(P>0.05)。因此，1 mmol/L NH4+對葛仙米生理生化特性的影響較為強(qiáng)烈，而 1 mmol/L K+和Cl-對葛仙米生理生化特性的影響較小。

李運(yùn)廣等的研究結(jié)果表明，高于400 mmol/L NaCl對葛仙米產(chǎn)生較強(qiáng)的鹽脅迫，葛仙米的可溶性糖含量隨NaCl濃度的升高而降低。高濃度的鹽主要是通過降低細(xì)胞外的離子平衡，從而引起膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器及酶結(jié)構(gòu)的破壞[8]。但本研究中，KCl和NH4Cl的濃度只有1 mmol/L，不足以對葛仙米產(chǎn)生強(qiáng)烈的鹽脅迫傷害。因此，1 mmol/L KCl對葛仙米的各項生理指標(biāo)沒有顯著影響。但1 mmol/L NH4Cl對葛仙米生理生化特性的影響強(qiáng)烈，因此，NH4+對葛仙米的影響機(jī)制不同于鹽脅迫。陳珍等研究表明，NH4+破壞了葛仙米光系統(tǒng)Ⅱ的放氧復(fù)合體[7-9]。

在本研究中，1 mmol/L NH4Cl引起葛仙米細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量顯著升高。在逆境脅迫條件下，植物體細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的代謝平衡被破壞，促進(jìn)植物體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致膜脂過氧化而生成丙二醛，影響細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)與功能[12]。MDA含量通常被用作膜脂過氧化程度的指標(biāo)[12]。脂膜過氧化還能影響植物光合作用和呼吸作用電子傳遞，從而導(dǎo)致活性氧自由基大量產(chǎn)生，進(jìn)一步引起膜脂過氧化[13]。

因此，為了保護(hù)野生葛仙米資源的生態(tài)環(huán)境，筆者建議在葛仙米生長區(qū)水稻田的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)該減少含氨氮的化學(xué)肥料的施用量。