GA3和ABA對2個黑穗醋栗品種二次萌發(fā)超微結構的影響

張椿浩， 劉慶帥， 薛曉曉， 秦 棟， 霍俊偉

(東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院/農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)新重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

黑穗醋栗(RibesmigrumL.)別稱黑加侖，俗稱黑豆，屬虎耳草科(Saxifragaceae)茶藨子屬[1]，非常適宜寒地栽培，在我國已有百年的栽培史，迄今是黑龍江省的特色漿果樹種之一[2]。黑穗醋栗果實中含有多種類黃酮、氨基酸、礦物質(其中Ca含量為水果之最)、醇類、酯類以及維生素(富含大量維生素A、B、C和B3)[3]。其中所含維C含量居我國現(xiàn)有野生漿果資源之首，有“維C王果”的美譽[4]。果汁中含有能夠阻斷強致癌物質亞硝基嗎啉合成的物質，具有一定抑制癌細胞的作用。黑穗醋栗籽中的γ-亞麻酸是人體必需脂肪酸之一，具有降血脂作用，并且它可通過減少前列腺素E2的產(chǎn)生可減輕炎癥反應[5]。黑穗醋栗色素屬于花色苷類，在食品、醫(yī)藥、日用化學工業(yè)上有著廣闊的應用前景[6]。

黑穗醋栗作為寒地小漿果的代表樹種，黑龍江種植面積較大，產(chǎn)量可以占到全國的75%左右[7]。但是在實際生產(chǎn)中，黑龍江地區(qū)黑穗醋栗種植常伴有“二次萌發(fā)”現(xiàn)象，嚴重威脅產(chǎn)業(yè)發(fā)展。二次萌發(fā)現(xiàn)象發(fā)生在8月，黑龍江地區(qū)有短暫的溫度驟升階段，有研究表明短暫的高溫處理會解除果樹休眠[8-10]，而此時的芽再次萌發(fā)使樹勢遭到破壞，樹體營養(yǎng)嚴重流失，影響翌年產(chǎn)量。前人在研究過程發(fā)現(xiàn)楊樹的芽季節(jié)性休眠中會發(fā)生細胞壁加厚、阻斷胞間連絲影響細胞間聯(lián)系的現(xiàn)象，從而起到促進休眠發(fā)生的作用[11]。冬小麥在春化解除休眠過程中，莖尖細胞發(fā)生了核膜孔開放，線粒體數(shù)量增加等現(xiàn)象[12]。這都說明了植物解除休眠進程與細胞超微結構有著相應的關系，但研究大多集中在細胞超微結構與春季萌發(fā)方面，二次萌發(fā)相關研究卻甚少。有關黑穗醋栗二次萌發(fā)的調控，筆者所在課題組已進行初步研究，發(fā)現(xiàn)25 mg/L GA3可明顯促進二次萌發(fā)，而50 mg/L ABA則會抑制二次萌發(fā)的發(fā)生[13]。本試驗以黑穗醋栗不易二次萌發(fā)品種黑豐和易二次萌發(fā)品種亞德為試驗材料，從細胞超微結構入手，通過不同激素處理比較芽細胞的特征變化，以期從細胞學角度揭示二次萌發(fā)現(xiàn)象的機理，為全面揭示黑穗醋栗二次萌發(fā)的機理提供科學依據(jù)，為人工調控黑穗醋栗二次萌發(fā)提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年8月在東北農(nóng)業(yè)大學黑穗醋栗種質資源圃進行，選擇8年生生長勢相對一致的黑豐和亞德各15株，試材常規(guī)管理，長勢中庸。黑豐屬于我國自己選育品種，自然條件下不易二次萌發(fā)，亞德是從俄羅斯引進品種，具有易二次萌發(fā)的特性。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理 配制30 mg/L GA3、50 mg/L ABA，以清水處理為對照，在果實采收后開始處理，于2015年8月12日進行第1次采樣，作為取樣空白對照。從8月13日開始，連續(xù) 3 d 對黑豐植株進行處理，噴施GA3、ABA和清水各5株，葉片滴水為止，然后剪取1年生枝條帶回試驗室，將芽剝離并進行超微結構試驗觀察固定。從8月16日開始觀察芽的形態(tài)學，在芽萌發(fā)的各個時期取1年生枝條的芽進行固定，用于超微結構觀察。

1.2.2 透射電鏡觀察 將取回的芽修成1 mm×3 mm大小，用2.5%戊二醛固定2 h，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值 6.8)漂洗3次，再用1%鋨酸固定液固定2～3 h，用 0.1 mol/L 磷酸緩沖液再漂洗3次。在4 ℃冰箱中按濃度梯度為50%、70%、90%、100%的乙醇分別進行15～20 min的脫水處理，后在室溫下用100%丙酮進行5～10 min的脫水處理。用純丙酮和包埋液在室溫下進行浸透，次日包埋。待包埋液聚合后修塊，用ULTRACUT-E超薄切片機切成50～60 nm 的薄片，再用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在東北農(nóng)業(yè)大學生命科技中心電鏡室內(nèi)通過H-7650X型透射電鏡觀察并拍片。

2 結果與分析

2.1 黑豐芽內(nèi)超微結構特征及變化

2.1.1 清水處理下黑豐芽內(nèi)超微結構特征及變化 不易二次萌發(fā)品種黑豐在清水處理下芽內(nèi)超微結構并沒有發(fā)生顯著變化。選擇處理前(8月12日)、處理后3 d(8月17日)和處理后9 d(8月21日)進行對比分析，8月12日采集的芽處于質壁分離狀態(tài)，細胞中游離淀粉粒，液泡中有電子致密物質，未觀察到有線粒體、內(nèi)質網(wǎng)和胞間連絲出現(xiàn)(圖1-1)。8月17日采集的芽仍處于質壁分離狀態(tài)，可清晰觀察到內(nèi)質網(wǎng)和線粒體，并且結構分化很完整；未觀察到有胞間連絲出現(xiàn)(圖1-2)。8月21日采集的芽細胞中質壁分離現(xiàn)象已經(jīng)消失，大部分細胞已經(jīng)形成中心大液泡，部分細胞液泡中仍有電子致密物質未分解；細胞中游離著淀粉粒未分解，可以清晰觀察到線粒體存在，并且結構分化很完整；未觀察到胞間連絲(圖1-3)。

2.1.2 GA3處理下黑豐芽內(nèi)超微結構特征及變化 不易二次萌發(fā)品種黑豐在GA3處理下芽內(nèi)超微結構發(fā)生顯著的變化。選擇處理前(8月12日)、處理后3 d(8月17日)和處理后7 d(8月21日)進行對比分析，8月12日采集的芽處于質壁分離狀態(tài)。8月17日采集的芽細胞質壁分離現(xiàn)象已經(jīng)消失，中心大液泡基本形成，液泡中的電子致密物質已經(jīng)分解；可以觀察到細胞中存在較大體積的淀粉粒，線粒體結構明顯，體積較大；觀察細胞壁可發(fā)現(xiàn)胞間連絲分化，細胞壁周圍有內(nèi)質網(wǎng)存在(圖1-4、圖1-5)。8月21日采集的芽細胞中心大液泡已經(jīng)形成，細胞質中游離少量淀粉粒，淀粉粒與17日相比體積明顯變??；線粒體體積減小，但數(shù)量增加；可以觀察到胞間連絲(圖1-6)。

2.1.3 ABA處理下黑豐芽內(nèi)超微結構特征及變化 不易二次萌發(fā)品種黑豐在ABA處理下芽內(nèi)超微結構發(fā)生較大的變化。選擇處理前(8月12日)和處理后7 d(8月21日)進行對比分析，8月21日采集的芽細胞處于質壁分離狀態(tài)；液泡中存在較多電子致密物質；淀粉粒數(shù)量較多，且體積較大；可以觀察到內(nèi)質網(wǎng)存在；線粒體和胞間連絲未發(fā)現(xiàn)(圖1-7)。

2.2 亞德芽內(nèi)超微結構特征及變化

2.2.1 清水處理下亞德芽內(nèi)超微結構特征及變化 易于二次萌發(fā)品種亞德在清水處理下芽內(nèi)超微結構變化明顯。選擇處理前(8月12日)、處理中(8月14日)和處理后14 d(8月26日)進行對比分析，結果表明，8月12日采集的芽細胞并沒有發(fā)生質壁分離現(xiàn)象；液泡占據(jù)細胞大部分體積；細胞中游離許多體積較小的線粒體；此時并未發(fā)現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)和胞間連絲結構(圖2-1)。8月14日細胞中液泡體積進一步增加，線粒體結構更加完整，體積變大；此時仍未觀察到內(nèi)質網(wǎng)和胞間連絲出現(xiàn)(圖2-2)。8月26日細胞形成中心大液泡；淀粉粒消失，線粒體數(shù)量減少，體積明顯增大，可以觀察到內(nèi)質網(wǎng)和胞間連絲(圖2-3)。

2.2.2 GA3處理下亞德芽內(nèi)超微結構特征及變化 8月12日芽細胞內(nèi)各類細胞器均存在，并未發(fā)生質壁分離現(xiàn)象(圖2-1)。8月14日細胞液泡通過水合作用逐步擴大；線粒體結構清晰，體積增大；可清楚觀察到胞間連絲(圖2-4)。8月21日細胞分化出細胞核，可以觀察到核仁的存在；細胞中形成了單獨的大液泡；淀粉粒數(shù)量明顯減少，線粒體數(shù)量進一步增加，體積變大；內(nèi)質網(wǎng)出現(xiàn)在細胞壁附近(圖2-5)。8月29日亞德已完全二次萌發(fā)，芽細胞已經(jīng)形成中心大液泡，細胞核分解消失；細胞壁周圍分布了豐富的線粒體和內(nèi)質網(wǎng)，胞間連絲對胞間聯(lián)系起到了積極作用(圖2-6)。

2.2.3 ABA處理下亞德芽內(nèi)超微結構特征及變化 ABA處理下亞德芽內(nèi)超微結構并未發(fā)生明顯變化。8月14日亞德芽細胞發(fā)生了部分質壁分離，并且淀粉粒體積較大；線粒體數(shù)量較多，但體積較小(圖2-7)。8月26日亞德芽細胞處于質壁分離狀態(tài)，淀粉粒已消失；細胞形成中心大液泡；線粒體和內(nèi)質網(wǎng)數(shù)量與之前相比明顯減少(圖2-8)。

3 討論

黑穗醋栗富含多種維生素、糖類和有機酸，是制作果醬、果酒、飲料等不可或缺的原料。我國目前的栽培面積已有 5 000 多hm2[14]，但黑龍江地區(qū)在實際生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的二次萌發(fā)現(xiàn)象嚴重影響了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。筆者所在課題組前期通過試驗已證明GA3和ABA可有效調控黑穗醋栗二次萌發(fā)現(xiàn)象[13]，但黑穗醋栗二次萌發(fā)的研究機理尚不清楚，尤其是細胞學方面。黑豐作為我國自主選育品種，具有不易二次萌發(fā)的優(yōu)良特性，本試驗通過激素處理，利用電鏡觀察芽的細胞超微結構，以期從細胞學角度解釋二次萌發(fā)的發(fā)生機理。

黑豐作為不易二次萌發(fā)的黑穗醋栗品種，在黑龍江地區(qū)具有較強的種植優(yōu)勢。亞德作為從俄羅斯引進品種，具有早熟等優(yōu)良性狀，但在秋季易發(fā)生二次萌發(fā)。本試驗通過GA3與清水處理的對比、ABA與清水的對比發(fā)現(xiàn)，GA3可有效促進質壁分離現(xiàn)象消失；而ABA則恰恰相反。丁小余等指出，細胞在休眠期普遍發(fā)生質壁分離現(xiàn)象，說明GA3可以促進黑穗醋栗打破休眠，從而促進二次萌發(fā)，ABA則是起抑制作用[15]。黃義江等對5個蘋果屬果樹品種抗寒性的研究中指出，質壁分離現(xiàn)象與胞間連絲關系密切，當質壁分離時胞間連絲相應中斷，二者成正比關系[16]。不易二次萌發(fā)的黑豐進行GA3處理，可以在芽細胞中觀察到胞間連絲出現(xiàn)，而清水和ABA處理黑豐均未發(fā)現(xiàn)胞間連絲分化。對易于二次萌發(fā)的亞德進行ABA處理，發(fā)現(xiàn)細胞未分化胞間連絲。與黑穗醋栗二次萌發(fā)情況相對應，總結出只有細胞分化出胞間連絲黑穗醋栗芽才可萌發(fā)。研究指出，崇明水仙頂端生長點進行超微結構觀察，在營養(yǎng)生長期胞間連絲處于“通路狀態(tài)”；休眠期間胞間連絲會被電子致密物質堵塞；隨休眠解除，電子致密物質會逐漸分解，胞間連絲回復暢通[17]。Jian等通過研究推測胞間連絲是否通暢可作為休眠或解除休眠一種響應機制[18]。本試驗并未觀察到胞間連絲的閉塞狀態(tài)，但激素處理具有鮮明對比，誘導胞間連絲分化可加強細胞間聯(lián)系，從而起到誘導黑穗醋栗二次萌發(fā)的效果。由此可看出，胞間連絲是黑穗醋栗能否二次萌發(fā)的關鍵所在。

每個植物細胞均有形成胞間連絲的潛在能力，通過胞間連絲的轉運功能，因此完整植物可以看成一個共質體[19]。質膜和內(nèi)質網(wǎng)橋構成了共質體通道，因此內(nèi)質網(wǎng)與細胞間物質運輸有密切關聯(lián)，對植物的解除休眠有一定影響。簡令成等對楊樹芽進行短日照處理誘導其進入休眠期，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)發(fā)生收縮，打破了膜系統(tǒng)之間的聯(lián)系；長日照處理的內(nèi)質網(wǎng)收縮消失[20]。本試驗通過GA3和ABA處理黑穗醋栗，與長短日照起類似作用，GA3處理后芽細胞內(nèi)質網(wǎng)出現(xiàn)更早，長度更長。由此推測內(nèi)質網(wǎng)在黑穗醋栗二次萌發(fā)過程中起重要作用。

線粒體作為細胞發(fā)生氧化還原反應和能量轉換的主要場所，線粒體敏感而容易發(fā)生變化[21]。高文遠等在浙貝母休眠前后超微結構比較中提出，細胞間物質與信息交換增加是細胞活躍的指標之一，線粒體大量出現(xiàn)在細胞壁周圍與胞間聯(lián)系增加有關[22]。通過對GA3處理的黑豐與亞德進行超微結構觀察發(fā)現(xiàn)，細胞中線粒體均出現(xiàn)在細胞壁胞間連絲周圍，這說明二次萌發(fā)過程中線粒體非?；钴S，為細胞間的聯(lián)系提供能量保障。GA3處理后線粒體分化數(shù)量明顯多于清水處理，并且結構更加完整，體積更大，可以為細胞代謝提供充足能量；ABA處理則可明顯觀察到線粒體體積與數(shù)量減小。清水處理條件下，亞德細胞中線粒體數(shù)量明顯多于黑豐。本試驗觀察到在二次萌發(fā)后期黑豐細胞中線粒體成紡錘狀，說明此時線粒體處于積極增殖時期[23]；而亞德細胞中線粒體此時已經(jīng)結構非常完整，內(nèi)部嵴狀結構清晰，已經(jīng)可以充分供能。

從超微結構觀察發(fā)現(xiàn)，黑穗醋栗芽細胞主要以淀粉粒的方式儲藏能量。隨著二次萌發(fā)進程的加深，淀粉粒體積不斷變小，數(shù)量減少，說明淀粉粒通過自身水解為細胞代謝提供能量。孫紅梅等發(fā)現(xiàn)，蘭州百合在解除休眠過程中淀粉含量逐漸減少，這與本試驗觀察淀粉粒體積和數(shù)量變化相吻合[24]。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同激素處理會對淀粉粒分解產(chǎn)生一定影響，GA3處理后細胞中淀粉粒完全分解，而ABA處理的細胞中仍可以觀察到淀粉粒存在。清水處理下，易二次萌發(fā)的亞德細胞中淀粉粒完全分解，而不易二次萌發(fā)的黑豐細胞中仍有淀粉粒剩余。這說明淀粉粒水解產(chǎn)生的能量對黑穗醋栗二次萌發(fā)起著重要作用。

液泡作為一個水相體系，積極地參與細胞代謝活動，對外界環(huán)境具有緩沖作用，維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本試驗發(fā)現(xiàn)8月12日黑豐液泡中存在電子致密物質，侯燕平等通過觀察冬季珍珠梅頂芽細胞結構得出結論，液泡中電子致密物質的積累是植物抗寒的一種預防機理[25]。清水處理下，黑豐與亞德細胞在二次萌發(fā)過程中液泡電子致密物質均發(fā)生降解，說明細胞處于解除休眠的過程中。ABA處理9 d后，黑豐液泡中仍可以觀察到有電子致密物質存在，而亞德細胞液泡中電子致密物質完全降解。液泡中電子致密物質未分解，則液泡濃度提高。方強恩在苜蓿根頸芽中同樣發(fā)現(xiàn)了液泡大量內(nèi)吞的現(xiàn)象，認為提高液泡濃度、降低冰點，有利于提升抗寒性[26]。因此，不易二次萌發(fā)的黑豐對于不良環(huán)境的抗逆性要強于亞德。

4 結論

黑穗醋栗二次萌發(fā)實際上是解除休眠的過程，休眠進程與細胞超微結構有著密切聯(lián)系。本試驗通過對2種黑穗醋栗進行激素處理，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GA3可加快細胞代謝，促進細胞加速休眠期解除進程。GA3與ABA、清水處理最大區(qū)別在于是否誘導了胞間連絲的分化。胞間連絲在胞間信息與物質傳遞過程中有著不可或缺的重要作用，這可能是決定黑穗醋栗是否可以二次萌發(fā)的關鍵原因。通過觀察其他細胞器，GA3處理下線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、淀粉粒均較ABA和清水處理更加活躍，這為二次萌發(fā)提供了物質基礎。質壁分離為檢驗細胞是否在休眠期中的一個指標，GA3處理大大加快了細胞打破休眠，而ABA則起抑制作用。液泡作為最敏感的細胞器，ABA處理使液泡中電子致密物質不分解，大大提高了植物預防不利環(huán)境因素的能力。

本試驗初步推測了黑穗醋栗二次萌發(fā)各個細胞器的代謝規(guī)律，但未與黑穗醋栗春季萌發(fā)相對比。在下一階段試驗中會加強這部分的研究，以期從細胞學的角度解釋黑穗醋栗二次萌發(fā)的發(fā)生機理。