激素和葉面剪除對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成及POD活性的影響

蔣潤(rùn)枝， 馬翠亭， 馮先楚， 楊蒙立， 程立寶

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

蓮藕(NelumbonuciferaGaertn)是睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬多年生水生草本植物，在我國有3 000多年的栽培歷史[1]，是我國主要水生蔬菜之一，以膨大根狀莖(俗稱藕)供食用，其營養(yǎng)豐富，深受群眾喜愛，是我國主要出口創(chuàng)匯型蔬菜之一[2]。蓮藕根系不發(fā)達(dá)，不定根的形成直接影響蓮藕植株的后期發(fā)育。因有性繁殖的實(shí)生苗幼苗期較長(zhǎng)，發(fā)育遲緩，影響植株后期的生長(zhǎng)發(fā)育，所以目前生產(chǎn)上通常采用無性繁殖的繁殖方法。通過雜交產(chǎn)生變異，再通過無性繁殖固定變異是蓮藕新品種創(chuàng)制的主要途徑，也是蓮藕新品種培育的主要手段，但通過有性雜交獲得的蓮藕實(shí)生苗不定根發(fā)生量較少，導(dǎo)致苗期較長(zhǎng)、植株當(dāng)年不能開花，進(jìn)而影響形成生產(chǎn)用種藕或商品藕。因此，發(fā)掘蓮藕實(shí)生苗不定根形成過程激素調(diào)控機(jī)制，是加速蓮藕新品種選育、縮短育種年限的有效途徑，也為加速蓮藕種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育奠定重要基礎(chǔ)。

吲哚乙酸(IAA)作為生長(zhǎng)素中最重要的一種內(nèi)源激素，參與植物發(fā)育的諸多過程，調(diào)控多種生理反應(yīng)。研究表明一定濃度的IAA可以顯著促進(jìn)作物根系的生長(zhǎng)發(fā)育[3-5]。過氧化物酶(POD)是IAA分解代謝的關(guān)鍵酶，在IAA分解代謝過程中起著關(guān)鍵作用，許多研究發(fā)現(xiàn)POD參與IAA的分解，植物的POD通過催化IAA氧化脫羧來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生長(zhǎng)素水平，從而保持植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[6]。乙烯能夠促進(jìn)果實(shí)成熟并具有對(duì)幼苗生長(zhǎng)的“三重反應(yīng)”(抑制莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、促進(jìn)莖或根的增粗與促進(jìn)莖的橫向生長(zhǎng))，此外它還具有誘導(dǎo)不定根和根毛的發(fā)生、促進(jìn)葉片衰老、打破種子和芽的休眠及促進(jìn)器官脫落等功能。目前，相關(guān)研究表明乙烯在不定根形成方面的影響主要有促進(jìn)[7-9]、抑制[10]和不作用[11]3種觀點(diǎn)。葉片剪除處理對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到一定的促進(jìn)作用。梁嫻等研究了在不同剪除方式下，草坪黑麥草根系活性的變化，適當(dāng)?shù)募舫螖?shù)和修剪高度能夠促進(jìn)草坪黑麥草根系活性的升高，說明剪除處理能夠促進(jìn)地下根系的生長(zhǎng)[12]。陳龔的研究表明，在一定程度上提高剪葉程度和次數(shù)，可明顯提高煙苗根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量、總根長(zhǎng)、根表面積及二級(jí)側(cè)根數(shù)[13]。

目前有關(guān)蓮藕實(shí)生苗不定根生長(zhǎng)發(fā)育的研究較少，乙烯、生長(zhǎng)素和葉片剪除方式對(duì)實(shí)生苗形成和POD活性的影響尚無報(bào)道，本試驗(yàn)研究了乙烯利、生長(zhǎng)素和葉片剪除處理之后的蓮藕實(shí)生苗不定根形成和對(duì)POD活性的影響，為深入解析蓮藕不定根形成的激素調(diào)控機(jī)理及種質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

1.1.1 乙烯和生長(zhǎng)素對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響 試驗(yàn)材料為江西太空蓮，在揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院的RXZ-300D智能人工氣候箱中培養(yǎng)，白天溫度30 ℃，夜間溫度24 ℃，濕度70%；該試驗(yàn)于2015年7月至2017年10月開展。待蓮籽(已破殼)充分吸水發(fā)芽后，即2張子葉之間有裂縫時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的實(shí)生苗放置于塑料盒(長(zhǎng)22 cm×寬 15 cm×高16 cm)中。利用不同濃度的IAA、TIBA、乙烯利和1-MCP(表1)處理蓮藕實(shí)生苗3 d后置于清水中培養(yǎng)，每2 d更換1次清水。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50株。

表1 不同溶液處理濃度

1.1.2 葉片剪除處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響 將已破殼的江西太空蓮蓮籽放在玻璃瓶(上口直徑5.5 cm，下口直徑6.5 cm，高7 cm)中培養(yǎng)，待蓮籽實(shí)生苗長(zhǎng)至5～7 cm時(shí)，對(duì)實(shí)生苗進(jìn)行剪除處理。此處理包括水面以上葉片剪除和水面以下葉片剪除2個(gè)處理(圖1)。水面以上剪除處理：用剪刀將實(shí)生苗的葉片和部分葉柄剪去，剪留葉柄長(zhǎng)度高于水面2 cm左右。水面以下剪除處理：在實(shí)生苗葉柄的3～4 cm 處用剪刀將上部葉片和葉柄剪除，并將剪口處用塑料薄膜封住，以防止水灌入葉柄。在2次剪除處理后(早、晚各1次)進(jìn)行第1次取樣，待水面以上剪除處理的蓮藕實(shí)生苗長(zhǎng)出不定根后進(jìn)行第2次取樣。

1.1.3 不定根數(shù)量的測(cè)定 待蓮藕實(shí)生苗長(zhǎng)出不定根之后，統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)≥0.5 mm的所有不定根數(shù)量，計(jì)算生根率：

生根率=生根種子個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù)×100%。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

本試驗(yàn)中所用到儀器包括酶標(biāo)儀、離心機(jī)；本試驗(yàn)中所用到的主要試劑包括過氧化物酶(peroxidase，POD)試劑盒(購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。

1.3 POD活性測(cè)定

使用過氧化物酶試劑盒測(cè)定樣品中過氧化物酶的活性。按照組織質(zhì)量(g) ∶提取液體積(mL)為1 g ∶10 mL的比例，稱取0.1 g混樣，加入1 mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，10 000g4 ℃離心10 min，去上清，置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟如下：

在微量石英比色皿或96孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄470 nm下30 s時(shí)的吸光值D1和1 min 30 s后的吸光值D2。

(1)分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至470 nm，蒸餾水調(diào)零。

(2)測(cè)定前將試劑一、二和三室溫放置10 min以上，然后進(jìn)行如下操作(表2)。

表2 樣品測(cè)定

(3)POD活性的計(jì)算。

單位定義：1 g組織在1 mL反應(yīng)體系中1 minD470 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位。

POD(U/g)=ΔD×V反總÷(m×V樣÷V樣總)÷0.01÷t=2 500×ΔD÷m。

式中：V反總表示反應(yīng)體系總體積，mL；V樣表示加入樣本體積，mL；V樣總表示加入提取液體積，mL；t表示反應(yīng)時(shí)間，min；m表示樣本質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA分析Duncan’s法(P<0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響

2.1.1 不同濃度IAA處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的影響 不同濃度的生長(zhǎng)素對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的效果不同。從圖2中可以看出，蓮藕實(shí)生苗經(jīng)低濃度的IAA處理后，能顯著促進(jìn)不定根數(shù)量的增加，其中15 μmol/L IAA處理效果好于75、125、175 μmol/L IAA 處理。利用15、75 μmol/L IAA處理后，在調(diào)查時(shí)間內(nèi)實(shí)生苗不定根形成數(shù)量始終顯著高于對(duì)照，而125 μmol/L IAA處理在后期促進(jìn)效果不明顯，后期甚至出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)；利用175 μmol/L IAA處理實(shí)生苗后1～6 d發(fā)現(xiàn)，不定根形成的數(shù)量極顯著低于對(duì)照。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的生長(zhǎng)素促進(jìn)蓮藕實(shí)生苗不定根的形成，而高濃度的生長(zhǎng)素則抑制不定根的發(fā)生。

2.1.2 不同濃度IAA處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響 表3為不同濃度IAA處理后蓮藕實(shí)生苗在6 d內(nèi)生根率的變化，從表3可看出，不同濃度IAA處理后的實(shí)生苗與對(duì)照組相比，15 μmol/L IAA效果最好，在5 d時(shí)生根率已達(dá)100%，生根率顯著高于對(duì)照。75、125 μmol/L IAA在 1～3 d有顯著促進(jìn)作用，在4、5 d時(shí)，75 μmol/L IAA處理較對(duì)照相比效果不明顯。125 μmol/L IAA在4 d時(shí)，較對(duì)照相比差異不顯著，而在5、6 d時(shí)，呈顯著負(fù)增加的趨勢(shì)。175 μmol/L IAAIAA處理后顯著抑制了實(shí)生苗的不定根生根率。

表3 不同濃度IAA處理后蓮藕實(shí)生苗生根率的變化

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達(dá)到0.05顯著水平，相同小寫字母表示在0.05水平上差異不顯著。下同。

2.2 TIBA對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響

2.2.1 不同濃度TIBA處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的影響 與IAA處理效果相反，不同濃度TIBA處理蓮藕實(shí)生苗后均對(duì)不定根數(shù)量產(chǎn)生抑制作用，抑制效果15 μmol/L好于10、5 μmol/L(圖3)。5、10 μmol/L TIBA處理后，蓮藕實(shí)生苗在1～4 d(2 d除外)不定根數(shù)量較對(duì)照相比顯著減少，6 d時(shí)，抑制效果達(dá)到極顯著水平。15 μmol/L TIBA在調(diào)查期內(nèi)始終極顯著地抑制了藕實(shí)生苗不定根的形成。

2.2.2 不同濃度TIBA處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響 從表4可看出，經(jīng)TIBA處理后，蓮藕實(shí)生苗的生根率與對(duì)照組相比呈顯著下降的趨勢(shì)。利用5、10、15 μmol/L TIBA處理后，生根率在1～6 d都顯著降低，隨濃度的增加抑制效果越明顯，當(dāng)對(duì)照生根率達(dá)100%時(shí)，5、10、15 μmol/L 處理的生根率僅達(dá)86%、79%、61%(第5 d)。

表4 不同濃度TIBA處理后蓮藕實(shí)生苗生根率的變化

2.3 乙烯利對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響

2.3.1 不同濃度乙烯利處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的影響 利用不同濃度(100、200、300 mg/L)的乙烯利處理蓮藕實(shí)生苗，結(jié)果如圖4所示。100 mg/L乙烯利處理后，與對(duì)照相比，不定根形成數(shù)量在1～3 d差異不顯著，4～6 d時(shí)，促進(jìn)效果達(dá)到顯著水平；200、300 mg/L乙烯利處理在1～3 d時(shí)顯著促進(jìn)不定根的形成，4～6 d時(shí)，促進(jìn)效果達(dá)到極顯著水平。以上結(jié)果表明，一定濃度的乙烯利能夠促進(jìn)蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的增加。

2.3.2 不同濃度乙烯利處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響 由表5可知，與對(duì)照相比，一定濃度的乙烯利能夠提高蓮藕實(shí)生苗不定根的生根率。在整個(gè)調(diào)查期間，其中 200 mg/L 乙烯利對(duì)生根率的促進(jìn)效果最佳，6 d時(shí)蓮藕實(shí)生苗生根率已達(dá)100%，與100 mg/L乙烯利之間差異顯著，與300 mg/L乙烯利之間差異不顯著。

表5 不同濃度乙烯利處理后蓮藕實(shí)生苗生根率的變化

2.4 1-MCP對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響

2.4.1 不同濃度1-MCP處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的影響 利用100、200、300 mg/L 1-MCP處理蓮藕實(shí)生苗，研究其對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根形成的影響。結(jié)果表明，100、200、300 mg/L 1-MCP在調(diào)查時(shí)間內(nèi)，均能顯著抑制不定根的生成，且200、300 mg/L 1-MCP的抑制效果好于100 mg/L(圖5)，說明降低植物體中內(nèi)源乙烯含量能抑制不定根的形成。

2.4.2 不同濃度1-MCP處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響 由表6可知，1-MCP處理后蓮藕實(shí)生苗的生根率在調(diào)查時(shí)間內(nèi)顯著降低。當(dāng)對(duì)照的生根率達(dá)100%時(shí)(5 d)，1-MCP處理過的實(shí)生苗生根率分別為85%、67%和70%。從作用效果來講，200、300 mg/L抑制作用好于 100 mg/L，200 mg/L 和300 mg/L之間無顯著差異。

2.5 葉片剪除處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根的影響

2.5.1 葉片剪除處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量的影響 水面以上葉片剪除處理和水面以下葉片剪除處理對(duì)影響蓮藕實(shí)生苗不定根形成的效果不同。圖6表明，與對(duì)照相比，水面以上葉片剪除處理顯著促進(jìn)了實(shí)生苗不定根的形成，葉片水面以下剪除反而抑制了實(shí)生苗不定根的形成。

表6 不同濃度1-MCP處理后蓮藕實(shí)生苗生根率的變化

2.5.2 葉片剪除處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根生根率的影響 由表7可知，葉片水面以上剪除處理顯著高于對(duì)照和葉片水面以下剪除處理。葉片剪除處理4 d，水面以上剪除處理生根率達(dá)100%，對(duì)照生根率為38.4%，而水面以下處理只有0，說明不同的葉片剪除方式對(duì)不定根的形成具有很大的影響(表6)。

表7 葉片剪除處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗的生根率的影響

2.6 不同處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗POD活性的影響

從圖7可知，經(jīng)過IAA和ETH處理的植株在24 h內(nèi)POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(圖7-A、圖7-C)，而TIBA、1-MCP和對(duì)照組植株P(guān)OD活性一直保持升高趨勢(shì)(圖7-B、圖7-D)。其中12 h時(shí)，1-MCP、IAA、TIBA、乙烯利處理的POD活力無明顯差異，但顯著高于對(duì)照，而在24 h時(shí)，POD活性大小依次為TIBA>1-MCP、對(duì)照>乙烯利>IAA處理，說明乙烯利和IAA均能改變植株體內(nèi)POD活性。

從圖7-E可知，對(duì)照POD活性呈現(xiàn)先下降后上升最后下降的趨勢(shì)，而葉片水面以下剪除POD活性一直高于葉片水面以上剪除POD活性。從圖7-F可知，在蓮藕實(shí)生苗長(zhǎng)出不定根后，對(duì)照POD活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；葉片水面以上剪除POD活性呈現(xiàn)出顯著高于葉片水面以下剪除POD活性而后低于葉片水面以下剪除POD活性的趨勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，15 μmol/L IAA能夠顯著提高蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量和生根率，而175 μmol/L IAA處理后顯著抑制了實(shí)生苗的不定根的數(shù)量和生根率，這表明低濃度的生長(zhǎng)素對(duì)不定根起到促進(jìn)作用，而高濃度的生長(zhǎng)素則抑制不定根的發(fā)生。一定濃度的乙烯利能夠促進(jìn)蓮藕實(shí)生苗不定根數(shù)量和生根率的增加，200、300 mg/L乙烯利效果最佳。植株葉片剪除處理對(duì)不定根有一定影響，與對(duì)照相比，水面以上剪除可以顯著促進(jìn)蓮藕實(shí)生苗不定根的生長(zhǎng)發(fā)育，水面以下剪除起到一定的抑制作用。由以上結(jié)論推測(cè)，POD可能通過影響生長(zhǎng)素含量來影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 討論

裴東等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入一定水平的IBA能夠誘導(dǎo)核桃子葉產(chǎn)生不定根[14]。江玲等發(fā)現(xiàn)，利用適宜濃度的吲哚乙酸處理萵苣幼苗的根部20～30 h，可促進(jìn)大量側(cè)根原基啟動(dòng)和突起[15]。王金祥研究表明，利用100 μmol/L乙烯利處理大豆插條，對(duì)其不定根的形成有一定促進(jìn)作用[16]；而孫逸超研究表明，5 μL/L 1-MCP可顯著抑制綠豆下胚軸不定根的發(fā)生[17]。以上報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn) 10 μmol/L IAA能夠顯著促進(jìn)蓮藕實(shí)生苗不定根的形成。另外一定濃度的乙烯利也能夠促進(jìn)蓮藕實(shí)生苗不定根的形成，這與謝陽姣等的試驗(yàn)結(jié)果[7]相似。劉國順等在烤煙漂浮育苗中發(fā)現(xiàn)，通過剪葉處理可以顯著提高根系活性，暗示剪葉處理較未剪葉的對(duì)照相比，能明顯地促進(jìn)根系的生長(zhǎng)發(fā)育[18]，這與呂芳等的研究結(jié)論[19]相一致。本試驗(yàn)對(duì)蓮藕實(shí)生苗進(jìn)行剪葉處理后，能顯著增加實(shí)生苗不定根數(shù)目和提高生根率，說明剪葉處理對(duì)蓮藕實(shí)生苗不定根的形成有顯著促進(jìn)作用。但凌啟鴻等的研究表明，在越冬前對(duì)小麥進(jìn)行剪葉處理，不僅明顯減少了分蘗穗數(shù)和每株穗數(shù)，且對(duì)次生根數(shù)有一定的抑制作用[20]，說明不同物種的葉面剪除效果可能不同。

外源刺激可導(dǎo)致植物體內(nèi)POD活性發(fā)生變化，這與物種種類、生長(zhǎng)習(xí)性等有關(guān)。廖祥儒等研究發(fā)現(xiàn)，用甘露醇和 6-BA 處理水稻后，明顯降低了POD的活性[21]。在小麥干旱脅迫研究試驗(yàn)中，陳軍等研究發(fā)現(xiàn)小麥萌發(fā)期在0～120 h期間，5%、15% PEG-6000脅迫下小麥POD活性呈逐漸上升趨勢(shì)，但15% PEG-6000脅迫下小麥POD活性比5% PEG-6000脅迫下其活性增幅大，25%、35% PEG-6000脅迫下小麥POD活性表現(xiàn)為先上升后下降[22]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，荔枝葉片細(xì)胞胞質(zhì)以及與壁以離子鍵和與壁以共價(jià)鍵結(jié)合的POD和IAA氧化酶(比)活性均上升，IAA氧化酶和POD(比)活性的增加，引起IAA含量下降[23]。本試驗(yàn)利用乙烯利、生長(zhǎng)素處理蓮藕實(shí)生苗，發(fā)現(xiàn)在24 h內(nèi)POD活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，而葉片水面以上剪除也得到相似的結(jié)果，說明POD活性可能與不定根的形成相關(guān)，但這種相關(guān)性是否和實(shí)生苗內(nèi)源IAA含量有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。