樟腦對彩絨革蓋菌抑制響應(yīng)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

李 權(quán)， 李本鵬， 齊文玉， 任 凱， 林金國

(1.凱里學(xué)院，貴州凱里 556011； 2.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院，福建福州 350002)

木材的腐朽不僅會造成大量的經(jīng)濟損失，還可導(dǎo)致嚴重的資源浪費，因此亟須對木材進行防腐處理[1]。為此，很多國家每年都投入大量的人力、物力研發(fā)新型木材防腐劑，以延長木材的使用壽命。現(xiàn)今對植物提取物進行的研究通常集中在抑菌防腐、抗氧化及其應(yīng)用等方面[2-5]。Voda等將含有酚類、酚醚類和芳香醛的植物精油用于對木材腐朽菌的抑菌測試，探討了精油中化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗真菌活性之間的關(guān)系，這是當前研究植物源提取物抑菌最常用的方法[6]；Lin等用5%肉桂葉的苯-乙醇提取物浸漬易腐朽的試材，明確了該植物提取物可以用于對易腐木材的防腐保護[7]；Tripathi等調(diào)查了馬纓丹根和莖的乙醇提取物對木材腐朽菌的抑制效果[8]；我國臺灣的Wang等從當?shù)赝寥夤鹑~片中提取精油用于木材防腐，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物中的主要成分是肉桂醛，相比其他成分具有更強的抑菌防腐功效[9]；李堅等也都對當?shù)氐牟糠帜透瘶浞N進行了提取，研究了植物提取物的抑菌防腐效果[10]。經(jīng)過檢測明確了幾種耐腐樹種的心材提取物對部分木霉菌、木材腐朽菌等真菌具有較強的抑制活性。

綜上所述，研究者已經(jīng)探索了眾多類型的植物源提取物的抑菌防腐功效，也報道了大量植物提取物對木材腐朽菌良好的抑菌防腐效果。然而目前為止，對于植物源提取物的研究多集中在現(xiàn)象報道階段，真正的機制研究還很少，導(dǎo)致在發(fā)展和利用植物源提取物防腐方面存在著理論依據(jù)的缺失。本試驗通過雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合，分析受到樟腦抑制的木材腐朽菌與對照的差異表達蛋白質(zhì)，從分子水平解析彩絨革蓋菌相關(guān)蛋白質(zhì)的表達，最終為探索樟腦對木材腐朽菌的抑制機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 白腐菌為彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)，由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 儀器與藥品 (1)儀器：固相pH值梯度等電聚焦儀EttanTM-IPGphorTMⅢ IEF System；垂直板電泳儀EttanTMDaltⅡ Vertical System，附件包括MutiTemp ⅢTM恒溫水浴以及EPS 3501 XL電源；5800型MALDI-TOF/TOF；ImageScanner Ⅲ光密度掃描儀；超速冷凍離心機；THY-111B型恒溫培養(yǎng)振蕩器。(2)藥品：固相pH值梯度干膠條(immobiline pH gradient，pH值3～10，長度=24 cm)；IPG緩沖液、IPG覆蓋液、TCA、β-巰基乙醇、兩性電解質(zhì)pharmalyte(pH值3～10)、丙烯酰胺、SDS、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺。樟腦購置于福建青松股份有限公司，用化學(xué)合成法制得，含量>96.0%。將樟腦用三氯甲烷溶劑制備成濃度為10 mg/mL的溶液。丙酮為分析純，上海中試化工總公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 接種與培養(yǎng) 試驗地點為福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院實驗室。在250 mL三角燒瓶中加入100 mL麥芽糖培養(yǎng)基(參照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能 第1部分：天然耐腐性實驗室試驗方法》麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基的配制不加瓊脂)，用5 mm打孔器在培養(yǎng)好的白腐菌培養(yǎng)皿上取出3個菌柄放入麥芽糖培養(yǎng)基中，將濃度為10 mg/mL的樟腦溶液 1 mL 加入到三角燒瓶中，與對照一起放入28 ℃、40 r/min振蕩箱中培養(yǎng)14 d后取出并真空抽濾得到菌絲。

1.2.2 TCA丙酮法提取菌絲蛋白質(zhì) 將抽干后的菌絲液氮研磨，加入20 mL的TCA/丙酮振蕩均勻后放入-20 ℃中沉淀過夜。將沉淀過夜后的樣品4 ℃、11 000 r/min離心 15 min，去上清，再加入20 mL-20 ℃預(yù)冷的冷丙酮(內(nèi)含0.07%β-巰基乙醇)振蕩，靜置2 h，然后11 000 r/min離心15 min，去上清(重復(fù)2次，洗至沉淀白色)，再放到真空干燥箱中真空抽干。按適當20 μL/mg標準加入裂解緩沖液，保持25～30 ℃超聲溶解2 h，最后11 000 r/min離心15 min后取上清即為蛋白樣品，對蛋白樣品濃度定量(濃度范圍為5～10 μg/μL)后放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳

1.2.3.1 等電聚焦(IPG-IEF) 主動上樣，水化和等電聚焦在EttanTM-IPGphorTMⅢ IEF System上自動進行，程序設(shè)置如表1所示。聚焦完畢后，分別用膠條平衡緩沖液Ⅰ(加DTT 10 mg/mL)和平衡緩沖液Ⅱ(加碘乙酰胺 25 mg/mL)，各緩慢平衡15 min。取出膠條后用濾紙小心吸去殘余平衡液，用電極緩沖液潤洗后轉(zhuǎn)入濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠板中，加入相對質(zhì)量標準的蛋白質(zhì)，進行二向垂直電泳。

表1 IEF參數(shù)設(shè)置

1.2.3.2 二向電泳與染色 將平衡好的IPG膠條貼于凝膠玻璃板上，加入1 mL瓊脂糖封膠液封住膠條，將凝膠板插入EttanTMDALT Ⅱ Vertical System的緩沖液柜中。在16 ℃水循環(huán)條件下進行電泳，恒功率4 W/條，待示蹤溴酚藍至凝膠底部邊緣時停止電泳，取出凝膠后待固定液固定后進行考染。

1.3 凝膠圖像分析

凝膠顯色后用Image Scanner掃描儀進行圖像掃描，運用Image MasterTM2D Platinum 7.0凝膠圖像分析軟件進行 2-DE 圖譜分析。

1.4 膠內(nèi)酶解

建立差異蛋白質(zhì)表達譜后，將新鮮的考馬斯亮藍染色的蛋白質(zhì)點從SDS-PAGE凝膠上割下切碎，置于96孔微孔板中。切碎的膠條首先用200 μL新鮮的含50 mmol/L NH4HCO3的50%乙腈溶液脫色2次，然后用200 μL乙腈干燥2次。干燥脫水的膠條加入消化液(含有12.5 ng/μL胰蛋白酶的20 mmol/L NH4HCO3溶液)孵育20 min，然后轉(zhuǎn)移到37 ℃孵育消化過夜。最后，用200 μL提取液(含5%甲酸的50%乙腈溶液)提取2次，收集上清液中的多肽合并。提取液在N2保護下干燥。

1.5 MALDI-TOF/TOF分析及數(shù)據(jù)的查詢

MALDI板用5800 MALDI-TOF/TOF分析儀(AB SCIEX)分析。每個點在m/z為700～3 600質(zhì)譜范圍內(nèi)采用正離子反射模式獲取一級質(zhì)譜，激光累積1 000次激發(fā)。MS數(shù)據(jù)用內(nèi)標進行校準，母離子的選擇按照如下標準：每點最多選擇50個母離子，信噪比最低設(shè)置為25，組分與組分間的質(zhì)量偏差設(shè)置為0.2 u。串聯(lián)質(zhì)譜采用2 500次激光累積和100分辨率的質(zhì)量窗口(半峰高寬度，F(xiàn)WHM)，碰撞能量設(shè)置為 2 kV，MS/MS數(shù)據(jù)采用默認校準，得到的數(shù)據(jù)通過軟件GPS(V3.6)采用MASCOT(V 2.3)進行檢索。搜索參數(shù)如下：真菌蛋白質(zhì)(1 757 520條序列；762 750 636個殘基)、胰酶酶切，1個漏切位點，一級質(zhì)譜的容差為0.1 u，二級質(zhì)譜的容差為0.6 u。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索后，蛋白質(zhì)得分>75分被認為鑒定成功(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體總蛋白雙向電泳圖譜的繪制

設(shè)計3次生物學(xué)重復(fù)，從圖1可以看出，所得電泳圖譜背景清晰，蛋白質(zhì)點分辨率高，蛋白質(zhì)點大規(guī)模聚集現(xiàn)象和橫縱向拖尾少。經(jīng)軟件對比發(fā)現(xiàn)，同一彩絨革蓋菌的3次生物學(xué)重復(fù)之間的蛋白質(zhì)點重復(fù)出現(xiàn)率超過92%，試驗結(jié)果可靠性極高。樟腦處理后彩絨革蓋菌以及對照之間蛋白點的分布大體相似，個別點則有較明顯的差異，說明這2種樣品所表達的蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量有所差別。

2.2 凝膠掃描結(jié)果分析

采用Image MasterTM2D Platinum 7.0差異分析軟件對樟腦處理白腐菌與對照的雙向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳圖譜進行比對分析，由圖2可知，2種蛋白雙向電泳圖譜格局基本一致，蛋白質(zhì)點主要集中在等電點(pI)4～7的范圍內(nèi)。樟腦處理白腐菌電泳圖和對照樣電泳圖中分別可分辨別出444、433個蛋白質(zhì)點，對各樣品蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜進行比較，蛋白質(zhì)豐度變化在2倍以上，并且3次生物學(xué)重復(fù)試驗的置信率大于95%(平均比值>2.0，方差<0.05)為條件進行篩選，共發(fā)現(xiàn)28個差異明顯的蛋白點，鑒定出15個蛋白質(zhì)點。其中編號為254、256、651、211、205、620、635的7個蛋白質(zhì)點下調(diào)，編號為634、618、624、540、613、201、537、605的8個蛋白質(zhì)點上調(diào)(圖3、表2)。

2.2.1 6-磷酸葡糖胺脫氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase，GNPDA) 6-磷酸葡糖胺脫氨酶是一種催化酶[11]，在糖胺代謝中起重要作用，可以催化6-磷酸葡糖胺通過脫氨和異構(gòu)2步反應(yīng)生成6-磷酸果糖；6-磷酸葡糖胺脫氨酶對于N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)是否被利用最終進入糖酵解途徑起關(guān)鍵作用[12]。葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(EC 3.5.99.6)是GlcNAc分解代謝途徑的終末酶[13]。

2.2.2 核糖體蛋白質(zhì)S5(ribosomal protein S5) 核糖體蛋白質(zhì)S5是核糖體蛋白質(zhì)家族的重要成員，在核糖體中發(fā)揮重要作用[14]，其生物學(xué)過程與細胞質(zhì)翻譯、核糖體小亞基組裝等有關(guān)。核糖體蛋白質(zhì)S5是構(gòu)成核糖體的重要成分，具有連接病毒和核糖體、調(diào)控細胞分化凋亡等核糖體外的功能，在蛋白質(zhì)翻譯準確性，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成以及tRNA轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著必不可少的作用[15]，與mRNA結(jié)合、rRNA結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分等分子功能有關(guān)。

2.2.3 絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶(Ser/Thr protein phosphatase) 絲/氨酸硫醇蛋白質(zhì)酶往往在其酶的活性中心含有絲氨酸的羥基或半胱氨酸的巰基，如胰蛋白質(zhì)酶、木瓜蛋白質(zhì)酶、糜蛋白質(zhì)酶、凝血酶、組織蛋白質(zhì)酶、彈性蛋白質(zhì)酶等，凡能與這些酶的活性中心結(jié)合、有效地降低其酶活性、又不使蛋白質(zhì)酶變性的物質(zhì)稱為絲氨酸硫醇蛋白質(zhì)酶抑制劑或絲氨酸巰基蛋白質(zhì)酶抑制劑。絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶屬于蛋白質(zhì)磷酸酶家族中重要的細胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，能夠催化磷酸化絲氨酸或使蛋白質(zhì)脫磷酸，并參與許多關(guān)鍵的生物學(xué)過程，在新陳代謝，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，細胞周期進程，信號傳導(dǎo)，細胞凋亡和胞外分泌等過程中均起重要作用[16]。

表2 樟腦處理彩絨革蓋菌差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定

2.2.4 假定ssDNA結(jié)合蛋白質(zhì)(putative ssDNA binding protein) 假定ssDNA結(jié)合蛋白(SSB)在細菌、古細菌和真核細胞的DNA復(fù)制、重組和修復(fù)中起著重要作用。

3 結(jié)論

本試驗采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)得到樟腦處理彩絨革蓋菌與對照的差異蛋白質(zhì)表達圖譜，經(jīng)分析得出以下結(jié)論：以2個樣品之間平均表達差異倍數(shù)大于2倍、且重復(fù)性好、差異表達變化明顯的蛋白質(zhì)點15個，其中8個蛋白質(zhì)點上調(diào)表達，7個蛋白質(zhì)點下調(diào)表達；絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶等蛋白質(zhì)的下調(diào)表達，說明白腐菌在新陳代謝，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，細胞周期進程，信號傳導(dǎo)，細胞凋亡和胞外分泌等方面也受到了抑制。本試驗結(jié)果可為新型木材防腐劑的研制以及闡明樟腦抑制白腐菌的分子機制提供參考。