天龍組方對腎虛證COPD大鼠肺功能及炎癥因子的作用※

周海祥 趙欽綿 夏鑫華*

（1 江西吉安市中心人民醫(yī)院中醫(yī)科，江西 吉安 343000；2 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 512000）

慢性阻塞性肺疾病 (COPD)是常見的呼吸道疾病，發(fā)病率及死亡率均較高。世界衛(wèi)生組織預(yù)言到2020年，COPD在“全球疾病死亡率”的排名將上升到第3位[1]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學對COPD的治療一直未有實質(zhì)性突破。常用的藥物治療只能緩解癥狀和/或并發(fā)癥，但不能扭轉(zhuǎn)COPD肺功能的長期下降[2]。尤其是在COPD的穩(wěn)定期，長期應(yīng)用支氣管擴張劑或糖皮質(zhì)激素治療，副反應(yīng)大，費用昂貴，且不能避免患者的反復感染，導致疾病纏綿難愈，病情進行性加重，患者的生活質(zhì)量嚴重下降，最終危及生命[3]。COPD的病理生理變化趨于影響全身各系統(tǒng)[4]，不斷惡性循環(huán)，使其防治措施更加復雜化，因此單一治療方法已不能取得較好的療效，近年的研究成果也從不同角度顯示出，中醫(yī)藥對COPD發(fā)生發(fā)展過程中各病理環(huán)節(jié)都有一定的作用。

本研究選用臨床療效確切的天龍組方，在以往的研究基礎(chǔ)上，通過對腎虛證COPD模型大鼠肺功能及炎癥因子IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α的蛋白表達等方面的研究，探討天龍組方對腎虛證COPD大鼠模型的干預(yù)作用及可能的分子機制，為中醫(yī)防治COPD提供新的思路和方法，具有一定的理論意義和較廣闊的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量 (260±20)g，購自廣東省實驗動物中心，生成許可證號：SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)在廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，室溫（22±2）℃，相對濕度30%～40%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 試劑和儀器 水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20110401）；ECL Plus發(fā)光試劑盒、SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α單克隆抗體 （abcam公司）；goat anti-rabbit（二抗，bioworld公司）；酶標儀（SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司）；電泳系統(tǒng)（Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司）；凝膠成像儀（ChemiDoc XRS+System，Bio-RAD公司）。

1.3 腎虛證COPD大鼠模型的復制 用熏吸香煙加氣管內(nèi)注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，在皮下注射醋酸氫化可的松建立復合腎虛證模型。第1 d、14 d氣道內(nèi)注入脂多糖 (LPS)0.2 mL (1 μg/μL，美國Sigma公司)，第2～13 d及第15～28 d放入自制的玻璃箱內(nèi)煙薰(紅雙喜烤煙型香煙，每天2次，每次1 h)；第22天起背部皮下注射濃度為25 mg/mL的醋酸氫化可的松，每天0.3 mL/只，連續(xù)8 d。

1.4 藥物、動物分組及給藥方法 天龍組方主要組成：青天葵10 g，款冬花15 g，法半夏10 g，制附片30 g，五味子5 g。購于廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，10倍量水煎煮2次，濾液濃縮后冷凍干燥成粉，臨用前蒸餾水適量復溶。依據(jù)70 kg成人用量折算成大鼠等效劑量。

雄性SPF級Wistar大鼠，體重 (260±20)g，隨機分為4組，正常組、模型組、天龍組方組、布地奈德組，每組10只。

正常組：第1 d、14 d氣道內(nèi)注入生理鹽水0.2 mL，第2～13 d及第15～28 d將大鼠放入自制的0.22 m3玻璃箱內(nèi) (每天2 h)，不用煙薰。在氣道內(nèi)注入生理鹽水前3 d及第2～13 d，第15～28 d在放入箱前用生理鹽水灌胃 (10 mL/kg/d)；模型組：按腎虛證COPD大鼠模型的復制方法造模，造模前3 d， 第2～13 d及第15～28 d用生理鹽水灌胃 (10 mL/kg/d)；天龍組方組：按模型組方法造模，造模前3 d，第2～13 d及第15～28 d用天龍組方煎劑灌胃（10 mL/kg/d，大鼠給藥劑量按體表面積公式換算）；布地奈德組：按模型組方法造模，每只大鼠從第21 d起每天薰煙前用霧化器在一密閉容積內(nèi)霧化吸入布地奈德混懸液，濃度為0.5 g/L的液體8 mL，50 min，余處理同模型組。

1.5 研究方法

1.5.1 肺組織形態(tài)學測量 取右肺下葉標本，用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋、蘇木精染色、切片。光鏡下觀察大鼠肺組織，確定COPD的病變及其治療效果。

1.5.2 肺功能測定 造模24 h后，大鼠分別用10%水合氯醛麻醉，并固定于手術(shù)板，縱向切開頸部皮膚約2 cm，分離皮下組織，暴露氣管，于環(huán)狀軟骨處作2個倒T型切口，插管后連接肺功能儀，將大鼠固定于體描箱內(nèi)。觀測大鼠通氣功能主要指標包括檢測大鼠FVC（用力肺活量），F(xiàn)EV1（第一秒用力呼氣容積），F(xiàn)EV1/FVC，F(xiàn)EF25%（用力呼氣流量25%），MMF（最大呼氣中期流速），PEF（最大呼氣流速）等肺功能指標。

1.5.3 ELISA法檢測 支氣管肺泡灌洗液BALF中IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α炎癥因子的水平采用的雙抗體免疫組化法測定樣品中IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α的水平。在預(yù)先包被IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α單克隆抗體的酶棟孔中加入樣品，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗涂，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中IL-6，IL-8，NF-κB， TNF-α的濃度呈線性。具體試驗操作參考試劑盒標準操作流程。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理結(jié)果 肺組織病理切片經(jīng)H&E染色，在光學顯微鏡下可見：正常組大鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，肺泡結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠細支氣管狹窄變形，呼吸性支氣管管腔狹小甚至閉塞，管壁明顯增厚，有小葉中型肺氣腫和全小葉型肺氣腫形成，肺間質(zhì)增寬，間質(zhì)中可見大量的炎性細胞浸潤，部分肺泡壁變薄，呈絲狀連接，多個肺泡融合形成肺氣腫。天龍組方組和布地奈德組大鼠的肺組織部分由肺間質(zhì)增寬，間質(zhì)偶有炎性細胞浸潤，病理損害輕重程度與模型組不同，經(jīng)治療后肺泡擴張和炎性浸潤得到明顯改善。

圖1 不同組別大鼠肺組織H&E染色病理切片

2.2 肺功能指標 如表1所示，與正常組相比，模型組FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、MMF水平顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，各用藥組FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、MMF水平均顯著提高 (P<0.05)。說明各用藥組大鼠的肺功能經(jīng)不同藥物治療后均得到不同程度的改善。

表1 不同組別間肺功能指標數(shù)據(jù)表 （±s）

表1 不同組別間肺功能指標數(shù)據(jù)表 （±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 FVC FEV1 FEV1/FVC正常組模型組天龍組方組布地奈德組21.40±1.32 12.13±1.82**17.64±1.96##18.01±1.34##36.87±2.58 28.51±1.99*34.60±2.75#33.91±3.18#1.72±0.35 2.35±0.51**1.96±0.27##1.88±0.64##FEF25% MMF 48.17±1.98 36.89±1.54**44.77±1.91#45.67±2.17#45.73±2.36 36.28±1.88*46.19±3.51##42.14±2.61#

2.3 BALF液中IL-6， IL-8， NF-κB， TNF-α的含量如圖2～5所示，模型組大鼠BALF液中炎癥因子IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α比正常組顯著升高，提示造模成功。給予天龍組方干預(yù)COPD大鼠后，炎癥因子IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α顯著下降，說明天龍組方可以對抗COPD過程中炎癥因子的釋放，緩解慢性炎癥，從而起到治療的藥效。同時，天龍組方藥效與陽性對照藥基本一致或稍優(yōu)，提示其在COPD臨床治療中具有一定的應(yīng)用前景。

圖2 不同組別間BALF液中IL-6含量比較圖

圖3 不同組別間BALF液中IL-8含量比較圖

圖4 不同組別間BALF液中NF-κB含量比較圖

圖5 不同組別間BALF液中TNF-α含量比較圖

3 討論

COPD按其臨床表現(xiàn)一般歸屬為中醫(yī)的“喘證”“肺脹”“水腫”等范疇，多為久咳、久哮、久喘遷延不愈發(fā)展而成。中醫(yī)藥對COPD的防治已取得一定的成效，研究內(nèi)容主要集中在COPD的病因病機，臨床治療及中醫(yī)藥作用機理等方面。對COPD的病因病機研究，主要集中在痰、瘀、虛三個方面，中醫(yī)認為內(nèi)在的臟腑功能失調(diào)導致的肺脾腎虛、痰濁、血瘀為本病的內(nèi)在病機病理變化，多傾向本虛標實，本虛以肺脾腎虛為主，標實為痰瘀為主，故臨床治療時應(yīng)“標本兼顧”，虛實同治。

課題組在長期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)：COPD患者因長期咳、痰、喘，耗傷肺氣，損及脾腎，致痰濁內(nèi)蘊，瘀滯內(nèi)生，痰瘀郁久亦易化熱，其標在肺，其本在脾腎。因而在急性期后仍具痰熱余邪依戀不清、壅塞肺氣的病機。故其治療應(yīng)在清肺化痰的同時，注意溫腎化痰與活血逐瘀。溫腎則氣納喘平，活血則瘀去痰易化。本項目組選用的天龍組方是由國家第二批名老中醫(yī)、中醫(yī)呼吸疾病專家邱志楠教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合COPD的病機特點，創(chuàng)制的以“溫腎活血化痰”為主要治法的中藥復方。方中主要藥物熟附子可振奮腎中之元陽，復其氣化衛(wèi)外之能；青天葵為兼治痰瘀熱之品，消痰解毒化瘀又不傷陰血耗氣，款冬花溫肺平喘；法半夏溫化痰飲，燥濕降逆，又能健運脾氣；五味子斂肺而滋腎。全方溫腎納氣并舉，攻補兼施并用。經(jīng)大量的臨床檢驗，療效確切，可顯著改善COPD患者緩解期的咳、痰、喘等癥狀，提高生活質(zhì)量，較好地保護肺功能，減緩肺功能下降，提高FEV1/FVC%、MMEF等指標。