柱前衍生結(jié)合高效液相色譜-熒光法測(cè)定水中草銨膦

王姍姍，俞瑞鮮，王菲迪，呂 露，吳聲敢，范 艷，趙學(xué)平

(浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

草銨膦是一種膦酸類、廣譜、非選擇性、觸殺性和非殘留性除草劑。與草甘膦相比，草銨膦更能有效去除多年生惡性雜草[1-3]。盡管草銨膦屬于非持久性農(nóng)藥，但其大量使用仍造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。大量研究表明，低劑量草銨膦會(huì)影響初生動(dòng)物腦部發(fā)育，動(dòng)物食用過量草銨膦會(huì)導(dǎo)致發(fā)抖、抽搐、呼吸困難等中毒癥狀。同時(shí)，草銨膦的不合理使用還會(huì)對(duì)水體造成污染，尤其對(duì)飲用水的污染將會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生重大威脅[4-7]。因此，很有必要建立一種簡(jiǎn)便、快速的草銨膦檢測(cè)方法。

草銨膦在結(jié)構(gòu)中含有膦酸基、氨基、羥基，是極強(qiáng)的兩性化合物。使用氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行草銨膦檢測(cè)時(shí)，需要將其轉(zhuǎn)化成可氣化的物質(zhì)，該操作會(huì)引入過多的其他試劑，且操作過程繁瑣，檢測(cè)效率和靈敏度都相對(duì)較低[8-11]。草銨膦紫外吸收弱，且很難在常規(guī)的C18柱子長(zhǎng)保留，所以使用液相色譜-紫外測(cè)定時(shí)靈敏度較低[12-13]。使用液相色譜-質(zhì)譜直接測(cè)定草銨膦時(shí)，儀器響應(yīng)較低，且需要離子交換柱等特殊柱子進(jìn)行分離。所以，目前文獻(xiàn)報(bào)道中常采用氯甲酸-9-芴基甲酯對(duì)草銨膦進(jìn)行柱前衍生，再結(jié)合液相色譜質(zhì)譜法和液相色譜-熒光法進(jìn)行草銨膦檢測(cè)[14-19]。雖然固相萃取小柱可以去除反應(yīng)體系中的硼酸鈉鹽和部分雜質(zhì)，但仍不能完全去除衍生化試劑水解產(chǎn)物和一些影響草銨膦定量的干擾雜質(zhì)。另外，衍生化試劑水解產(chǎn)物濃度高，進(jìn)入質(zhì)譜會(huì)造成離子源的污染，影響質(zhì)譜的穩(wěn)定性，干擾草銨膦的準(zhǔn)確定量。本文采用液相色譜-熒光法在Waters Atlantis?T3色譜柱上對(duì)草銨膦衍生化產(chǎn)物進(jìn)行分離，在不使用固相萃取小柱的前提條件下，排除了雜質(zhì)對(duì)草銨膦定量的干擾，為水中草銨膦的檢測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(色譜純，Merck公司)，乙酸銨(色譜純，美國(guó)Tedia公司)，飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，丙酮(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，二氯甲烷(分析純，杭州雙林化工試劑廠)，四硼酸鈉(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，氯甲酸-9-芴基甲酯(分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，草銨膦(純度97.5%，購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、熒光檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器)，Waters Atlantis?T3液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，美國(guó)Waters公司)，GEMINI C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，美國(guó)Phenomenex公司)，CNWBON LC-C18固相萃取柱(500 mg/6 mL，上海安譜公司)，OASIS HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美國(guó)waters公司)，AB104-S電子天平(感量0.000 1 g，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)，OHAUS SPS202F 型電子天平(感量0.01 g，奧豪斯儀器常州有限公司)，MX-S可調(diào)式混勻儀(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，HH-4 恒溫水浴鍋(江蘇金壇市江南儀器廠)，10 mL棕色樣品瓶，移液槍，容量瓶等。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液、緩沖鹽溶液和衍生化試劑的配制

草銨膦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液。電子天平稱取草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品0.020 5 g(純度為97.5%)，用飲用純凈水定容至10.00 mL，得到濃度為2.00×103mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用飲用純凈水逐級(jí)稀釋草銨膦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，得到濃度為0.200、0.100、0.050 0、0.020 0、0.010 0、0.005 00和0.002 00 mg·L-1的草銨膦標(biāo)準(zhǔn)工作液。

四硼酸鈉緩沖溶液。稱取3.80 g四硼酸鈉，用飲用純凈水定容至100.0 mL，得到濃度為0.100 mol·L-1的四硼酸鈉水溶液。

氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液：稱取0.10 g氯甲酸-9-芴基甲酯，用分析純丙酮定容至100.0 mL，得到濃度為1.0 mg·mL-1的氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液。

1.4 色譜條件

Waters Atlantis?T3液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20.0 μL，流速。0.8 mL·min-1，流動(dòng)相A為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液(稱取0.385 4 g乙酸銨，用飲用純凈水定容至1 L，0.22 μm濾膜過濾后使用)，流動(dòng)相B為色譜純乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，90%A；1～12 min，90%A～50%A；12～13 min，50%A；13～14 min，50%A～10%A；14～17 min，10%A；17～17.1 min，10%A～90%A；17.1～25 min，90%A。

1.5 樣品衍生

移取1 mL水樣于10 mL棕色玻璃樣品瓶中，分別依次加入0.5 mL 0.1 mol·L-1的四硼酸鈉水溶液和1 mL 1 mg·mL-1的氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液，蓋緊瓶蓋，渦旋約30 s，在40 ℃的水浴下反應(yīng)30 min。反應(yīng)完成后，將全部液體轉(zhuǎn)移至10 mL的刻度管中，加入4 mL的分析純二氯甲烷，振蕩1 min，室溫下靜置約10 min后取上層水樣過0.22 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

通過對(duì)比不同的衍生化試劑體積(0.5、1.0和2.0 mL)、硼酸鈉緩沖鹽體積(0.5、1.0和2.0 mL)以及衍生化時(shí)間(0.5、1.0、1.5和2.0 h)來(lái)確定最優(yōu)的衍生化條件。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇衍生化試劑體積1 mL，硼酸鈉體積0.5 mL和衍生化0.5 h作為草銨膦衍生化反應(yīng)的最終條件。

2.2 固相萃取條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15，18]，比較CNWBON LC-C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)和OASIS HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL)的凈化效果表明，以上2種固相萃取小柱都無(wú)法去除衍生化試劑的水解產(chǎn)物和干擾草銨膦衍生化產(chǎn)物定量的雜質(zhì)，故本實(shí)驗(yàn)中不再使用固相萃取小柱，而是選擇合適的液相柱子排除雜質(zhì)對(duì)草銨膦定量的干擾。

2.3 流動(dòng)相和色譜柱的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]，選擇乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨水溶液作為衍生化產(chǎn)物的色譜分離的流動(dòng)相，通過調(diào)整兩者的比例確定最優(yōu)的液相條件。對(duì)Waters Atlantis?T3色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和Phenomenex GEMINI C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)的分離效果考察結(jié)果表明，以上2種柱子都可將衍生化試劑水解產(chǎn)物和草銨膦衍生化產(chǎn)物很好的分離，但使用Phenomenex GEMINI C18液相色譜柱時(shí)，無(wú)法將草銨膦衍生化產(chǎn)物與其極性相似的干擾雜質(zhì)分離，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確定量草銨膦(圖1)。使用Waters Atlantis?T3色譜柱，采用1.4色譜條件進(jìn)行草銨膦衍生物分離時(shí)，不僅可獲得很好的峰形，而且可實(shí)現(xiàn)草銨膦衍生化產(chǎn)物與其干擾雜質(zhì)的基線分離，從而保證草銨膦的準(zhǔn)確定量(圖2)。

圖1 草銨膦衍生化產(chǎn)物(0.00 500 mg·L-1)的Phenomenex GEMINI C18柱色譜圖

圖2 草銨膦衍生化產(chǎn)物(0.00 500 mg·L-1)的Waters Atlantis? T3柱色譜圖

2.4 線性關(guān)系、回收率和精密度

如圖3所示，將0.002、0.005、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100和0.200 mg·L-1的草銨膦標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生化產(chǎn)物進(jìn)樣分析，以草銨膦濃度、草銨膦衍生化產(chǎn)物峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=2 701.5x+1.305 2(R2=0.999 9)。

圖3 草銨膦標(biāo)準(zhǔn)曲線

在自來(lái)水中添加3檔濃度的草銨膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0.003 00、0.300和30.0 mg·kg-1，每檔濃度設(shè)5個(gè)平行樣品。平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1，該方法的檢出限(S/N=3)為0.000 370 mg·kg-1，定量限(S/N=10)為0.001 23 mg·kg-1。

表1 不同添加水平下自來(lái)水中草銨膦的 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 小結(jié)

本文采用柱前衍生-高效液相色譜-熒光法建立了水中草銨膦的檢測(cè)方法，該方法不需要固相萃取小柱即可排除雜質(zhì)對(duì)草銨膦定量的干擾，且由于排除了雜質(zhì)的干擾，使得該方法的檢出限為0.000 370 mg·kg-1，定量限為0.001 23 mg·kg-1，可與液相色譜-質(zhì)譜相媲美，同時(shí)還可避免高濃度的衍生化試劑水解產(chǎn)物對(duì)離子源的污染，為水中草銨膦的檢測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。