潔白丸微生物限度檢查方法的探討

杜海娟，滕寶霞，牟建平

（甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070）

潔白丸為非滅菌的口服中藥制劑，具有健脾和胃、止痛止吐、分清泌濁之功效，主治胸腹脹滿、胃脘疼痛、消化不良、嘔逆泄瀉、小便不利[1]。在按現(xiàn)行藥典[2]要求進(jìn)行微生物限度檢查過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)潔白丸對(duì)微生物有抑制作用，本文探討潔白丸微生物限度檢查方法，具體如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 潔白丸

金訶藏藥股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z63020077，規(guī)格：0.8 g/丸。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）44104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003）]、乙型副傷寒沙門(mén)菌[CMCC（B）50 094]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]和黑曲霉[CMCC（F）98 003]，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)于青島海博生物科技有限公司。

1.4 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電冰箱、顯微鏡、電熱恒溫干燥箱、壓力消毒器、天平。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種培養(yǎng)及稀釋[2]

實(shí)驗(yàn)所用菌種為第3代，菌懸液為第4代。

2.2 回收率計(jì)算

回收率=（實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)-供試品本底菌數(shù)）÷陽(yáng)性菌數(shù)×100%。

2.3 供試液制備

取潔白丸10 g加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，溶解、混勻，制成1∶10供試液。

2.4 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法

2.4.1 常規(guī)法（1）實(shí)驗(yàn)組。取潔白丸1∶10供試液，分別加入5種實(shí)驗(yàn)菌株（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，制成每毫升潔白丸1∶10供試液含菌數(shù)小于100 cfu，取含菌的樣品溶液1 ml，每個(gè)菌液注2個(gè)平皿，注入所需培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。（2）菌液對(duì)照組。分別取5種實(shí)驗(yàn)菌的菌懸液（50～100 cfu）1 ml注皿，加培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。（3）供試品對(duì)照組。用供試品替代實(shí)驗(yàn)組液體注皿，實(shí)驗(yàn)。（4）陰性對(duì)照組。用同批配制、滅菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1 ml替代樣品注皿，注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果顯示，采用1∶10供試液1 ml注皿，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌回收率小于50%。

表1 潔白丸計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)（平皿法）

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法（1）實(shí)驗(yàn)組。取潔白丸1∶10供試液，分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液，制成每毫升潔白丸1∶10供試液含菌數(shù)小于100 cfu，取含菌的樣品溶液0.5 ml、0.2 ml，置無(wú)菌平皿中，每個(gè)菌液每個(gè)取樣體積注兩個(gè)平皿，注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。（2）菌液對(duì)照組、供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)方法同常規(guī)法。具體見(jiàn)表2。

表2 潔白丸計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)（培養(yǎng)基稀釋法）

結(jié)果顯示，采用1∶10供試液0.2 ml注皿，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率大于50%，白色念珠菌回收率小于50%。

2.4.3 供試液稀釋法（1）實(shí)驗(yàn)組。取潔白丸1∶10供試液，10倍稀釋制成1∶100供試液，加入白色念珠菌菌懸液，制成每毫升潔白丸1∶100供試液含菌數(shù)小于100 cfu，取含菌的樣品溶液1 ml，置無(wú)菌平皿中，每個(gè)菌液注2個(gè)平皿，注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。（2）菌液對(duì)照組、供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)方法同常規(guī)法。具體見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，采用1∶100供試液1 ml注皿，白色念珠菌回收率高于50%。

2.4.4 計(jì)數(shù)檢查方法的確認(rèn) 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用1 ml（1∶100）注皿方法，加入5種陽(yáng)性菌的回收率均在50%～200%之間，檢查方法滿足《中國(guó)藥典》2015年版四部微生物限度方法適用性要求，檢查方法可行，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 潔白丸計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)（供試液稀釋法）

表4 潔白丸計(jì)數(shù)方法適用性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

2.5 控制菌方法適用性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 大腸埃希菌 采用《中國(guó)藥典》2015年版四部148頁(yè)大腸埃希菌常規(guī)方法[2]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以檢出陽(yáng)性菌（大腸埃希菌），見(jiàn)表5。

2.5.2 耐膽鹽革蘭陰性菌 采用《中國(guó)藥典》2015年版四部147頁(yè)耐膽鹽革蘭陰性菌常規(guī)方法[2]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以檢出陽(yáng)性菌（大腸埃希菌和銅綠假單胞菌），見(jiàn)表6。

表5 大腸埃希菌方法適用性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

表6 耐膽鹽革蘭陰性菌方法適用性實(shí)驗(yàn)

2.5.3沙門(mén)菌 采用《中國(guó)藥典》2015年版四部147頁(yè)沙門(mén)菌常規(guī)方法[2]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以檢出陽(yáng)性菌（沙門(mén)菌），見(jiàn)表7。

3 討論

（1）采用1∶100供試溶1 ml注皿，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)回收率均大于50%，按《中國(guó)藥典》2015年版四部1105、1106微生物計(jì)數(shù)法檢查，方法可行。

（2）控制菌（大腸埃希菌、沙門(mén)菌、耐膽鹽革蘭陰性菌）按《中國(guó)藥典》2015年版四部1106、1107控制菌檢查法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，能檢出陽(yáng)性菌，方法可行。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金訶藏藥股份有限公司生產(chǎn)的潔白丸對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的生長(zhǎng)有抑制作用。潔白丸是由訶子（煨）、南寒水石、翼首草、五靈脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰華、紅花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁14味中藥制成[3]，其中訶子具有較強(qiáng)的抑菌作用[4]，沉香能抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)[5]。

表7 沙門(mén)菌方法適用性實(shí)驗(yàn)

[1]陳來(lái).藏藥潔白丸簡(jiǎn)介[J].河南中醫(yī)，2012（10）：1371.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3]包桂芬.藏藥“潔白丸”主要藥物分析[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996（4）：

49-50.

[4]孟祥鋒，劉春月.訶子等中草藥源農(nóng)藥對(duì)常見(jiàn)植物病原菌的抗菌活性研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（19）：149-150.

[5]廖建良，吳國(guó)祥.沉香提取物的抑菌活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（6）：285-287.