干旱脫水對狗牙根葉片光合機構的影響

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(新疆農業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院，新疆草地資源與生態(tài)實驗室，新疆 烏魯木齊 8320052)

狗牙根(CynodondactylonL.)為禾本科多年生草本，是暖季型草坪草中應用最廣的草種之一，因其具有生長速度快、再生能力強、成坪快、耐熱、耐踐踏、色澤好等優(yōu)點，被國內外廣泛應用于運動場、游憩場及固土護坡[1]。近些年來，隨著全球變暖和環(huán)境惡化，干旱問題日益嚴重。狗牙根由于其生境特點，常常遭受干旱脅迫，生長和發(fā)育受到限制。

光合作用是植物生長發(fā)育所需能量的主要來源，干旱脅迫下，植物水分大量散失，導致植物組織脫水。葉片遭受輕度脫水后氣孔關閉，光合作用受限；葉片重度脫水會導致植物組織結構受損、代謝受抑加重植物光合作用的非氣孔限制，從而使植物光合作用嚴重下降[2-3]。干旱脫水常常伴隨著其他脅迫如高溫[4]、強光[5]、鹽脅迫[6]等的發(fā)生，多重脅迫下，光合作用受抑，會導致脫水葉片光抑制加重，活性氧大量積累從而對光合機構產生不可逆的傷害。但目前對于脫水脅迫直接傷害葉片光合機構的了解較少。

光合機構由光系統(tǒng)1(PSⅠ)和光系統(tǒng)2(PSⅡ)共同組成，二者相互作用。當PSI和PSII之間的電子傳遞被抑制，會導致PSII受體測電子傳遞受阻，同時導致PSI受體側電子供應不足。PSⅠ活性下降時，PSII流向PSI的電子被阻斷，在光下會導致PSII產生大量活性氧，加重PSⅡ光抑制。由于PSⅠ研究手段的限制，此前關于光合機構對于干旱脫水的響應多集中于PSⅡ[7-8]。脫水脅迫是否會傷害PSⅠ活性，以及脫水是否會影響PSⅠ和PSⅡ之間的相互作用，這些問題有待解決。

植物對820nm光的吸收反映了PSⅠ的氧化還原能力，因此利用植物對820nm光的吸收技術可以分析PSⅠ光化學活性的變化[9-10]?？焖偃~綠素熒光測定和分析技術(JIP-test)可以快速分析PSⅡ光化學活性的變化。本實驗利用這兩種技術，研究了脫水脅迫對狗牙根葉片PSⅠ和PSⅡ及其兩者之間相互作用的影響，為狗牙根的抗旱育種及新品種推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試葉片取自新疆農業(yè)大學試驗場建成草坪，清晨日出之前選取生長健康、長勢一致的葉片用于實驗處理。

1.2 葉片脫水處理

為了排除光合電子傳遞鏈介導的活性氧的傷害，本實驗在黑暗室溫下進行。黑暗條件下，將10片新農1號狗牙根(CynodondactylonL. ‘Xin nong No.1’)葉片懸掛在均勻流動的空氣中進行脫水處理，在28℃下脫水25小時直到葉片相對含水量下降到約25%左右。對照組用濕紗布包裹，相同條件下處理相同的時間。

1.3 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線

參考Strasser等[10]的方法，葉片先暗適應20 min，然后利用M-PEA(Hansatech, 英國)測定葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(O-J-I-P曲線)。O-J-I-P熒光誘導曲線用JIP-test進行分析，計算以下參數(shù)：

PSII的最大光化學效率Fv/Fm=φPo =1-( Fo/Fm)；J點標準化后的相對可變熒光 Vj=(Fj-Fo)/(Fm-Fo)；PSII反應中心捕獲的光能中進入電子傳遞鏈的概率ψO= ETo/TRo=1-Vj；單位面積吸收的光能ABS/CSm=Fm；光合性能指數(shù)PIABS=(RC/ABS)·[φPo/(1-φPo)]·[ψO/(1-ψO)]。

1.4 P700活性的測定

P700活性根據Schansker等[9]的方法使用PEA Senior(Hansatech，英國)進行測定，用△I/Io反映PSI活性。

1.5 葉片相對含水量的測定

葉片離體后立刻測定鮮重，水中浸沒12小時后測定飽和鮮重，然后在鼓風烘箱中在 80℃烘干48小時，測定干重，用如下公式計算得出處理前葉片的相對含水量(relative water conter,RWC)約為83%。

計算公式：RWC(%)=(鮮重-干重)/(飽和重-干重)

試驗葉片離體后及脫水處理不同時間后測定鮮重，脫水處理結束后將葉片放入鼓風烘箱中在 80℃烘干48小時，測定干重，以脫水處理前葉片的相對含水量為83%計算不同脫水時間葉片的相對含水量。

1.6 葉片葉綠素含量的測定

取狗牙根葉片，剪碎，稱取2 g左右，放入刻度試管中，加10 ml乙醇：丙酮(1:1)混合液于黑暗條件下浸提24小時。用CS-190分光光度計測定吸光值，以丙酮為空白，在波長為665 nm、649 nm和470 nm進行比色，按照如下公式進行計算：

葉綠素a(Chl a /μg·g-1)=(12.7*A663—2.69*A645)/100*DW

葉綠素b(Chl b /μg·g-1)=( 22.9*A645—4.68*A663)/100*DW

類胡蘿卜素(Caretenoid /μg·g-1)=[4.7*A440—0.27*(Chl a-Chl b)]/100*DW

1.7 數(shù)據分析

采用Microsoft Excel 2003 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據，用Sigma plot作圖。所有數(shù)據均為10次重復測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 脫水對狗牙根葉片相對含水量的影響

在室溫黑暗下，隨著脫水的進行，葉片RWC呈線性逐漸下降，最終下降到25%左右；對照組經過相同時間處理，相對含水量無顯著下降(圖1)。

圖1 黑暗脫水處理不同時間后葉片相對含水量隨處理時間的變化。每個數(shù)據均為10次重復的平均值Fig.1 The RWC in Cynodon dactylon L. leaves dehydrated at 28℃ in the dark for different times. Each value is the mean±SE(n=10)

2.2 脫水對狗牙根葉片色素含量的影響

葉片光合機構是一個高度密集的多亞單位色素蛋白復合體。從圖2 觀察到，脫水脅迫導致狗牙根葉片葉綠體色素a、b和類胡蘿卜素含量顯著下降，其中葉綠素a下降程度最大。這表明，脫水脅迫會導致葉綠素降解，從而導致葉片光合機構的數(shù)量減少。

圖2 黑暗脫水處理對葉片葉綠素a(Chl a)、葉綠素b (Chl b)和類胡蘿卜素(Car)含量的影響。每個數(shù)據均為10次重復的平均值Fig.2 Effects of dehydration treatments on content of Chl a, Chl b, Car in Cynodon dactylonL. leaves. Each value is the mean±SE(n=10)

2.3 脫水對狗牙根葉片PSⅡ光化學活性的影響

快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP曲線)被廣泛應用于PSII活性研究中[9-11]。在進行O-P點標準化的曲線中(圖3)，脫水處理前葉片呈現(xiàn)出了典型的OJIO曲線，而隨著不同脫水時間的處理，葉片的OJIP曲線出現(xiàn)顯著差異。脫水處理后的葉片OJIP曲線上的J點(2 ms)和I點(30 ms)熒光都有上升。隨著脫水處理時間的延長，J點和I點上升程度增加。

圖3 脫水處理不同時間對離體葉片OJIP曲線的影響.OJIP曲線按照Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)進行標準化(A)，B圖為脫水不同時間與處理前的曲線的差值ΔVt=Δ(Vt-Vt0h)Fig.3 Effects of dehydration treatment on OJIP curve of isolated leaves at different time. The OJIP curve is normalized according to Vt = (Ft-Fo)/(Fm-Fo) (A). B is the difference ΔVt=Δ(Vt-Vt0h) between the dehydration time and the curve before treatment

PSII供體側受到傷害即放氧復合體(OEC)傷害時，OJIP曲線的300 μs處出現(xiàn)的K點會上升。為了觀察K點，我們將OJIP曲線進行O-J點標準化(圖4)，發(fā)現(xiàn)脫水處理后葉片的OJIP曲線K點均呈上升趨勢，脫水到25 h后，K點顯著上升。

圖4 脫水處理不同時間對離體葉片OJIP曲線的影響OJIP曲線按照Wt=(Ft-Fo)/(Fj-Fo)進行標準化(A)，B圖為脫水不同時間與處理前的曲線的差值ΔWt=Δ(Wt-Wt0h)Fig.4 Effects of dehydration treatments on theOJIP curve of isolated leaves at different time. The OJIP curve was normalized according to:Wt=(Ft-Fo)/(FJ-Fo)(A), and B is the differences of ΔWt=Δ(Wt-Wt0h) between the dehydration time and the curve before treatment

葉片最大光化學效率Fv/Fm反映PSII天線吸收的光能被反應中心捕獲的概率，圖5A表明，隨著脫水的進行，葉片最大光化學效率都逐漸下降，但當葉片RWC降至25%時，F(xiàn)v/Fm僅下降到對照組的10%左右。電子傳遞到QA以下的效率(Ψo，圖5A)反映被PSII反應中心捕獲的能量進入電子傳遞鏈的概率，隨著脫水時間的增加，處理葉片的Ψo均有下降，并且在脫水處理10 h后，Ψo大幅下降。單位面積吸收的光能(ABS/CSm，圖5A)反映PSII 天線吸收光能的能力，隨著脫水處理，葉片ABS/CSm逐漸下降，與Ψo相似，在脫水10 h后大幅減小。隨著脫水進行，光合性能指數(shù)(PIABS，圖5A)逐漸下降，與Fv/Fm相比，下降程度更大，對脫水脅迫更敏感。

為進一步闡明PSII光化學活性與葉片脫水狀態(tài)之間的關系，我們研究了PSII活性相關參數(shù)隨葉片RWC的變化。隨著葉片RWC逐漸下降，葉片F(xiàn)v/Fm、Ψo、ABS/CSm和PIABS都逐漸下降，其中，葉片RWC對葉片F(xiàn)v/Fm的影響最小，葉片光合性能指數(shù)PIABS對于葉片RWC最敏感。由圖5B可知，葉片RWC下降到60%之前，對Fv/Fm、Ψo、ABS/CSm影響較小，當葉片RWC下降到60%之后，F(xiàn)v/Fm、Ψo、ABS/CSm開始大幅下降。

圖5 脫水處理后葉片F(xiàn)v/Fm,Ψo, ABS/CSm和PIABS隨處理時間(A)和葉片相對含水量(B)的變化。處理前Fv/Fm和Ψo的值被作為100%，處理后的Fv/Fm和Ψo換算為處理前值的百分比。每個數(shù)據均為10次重復的平均值Fig.5 The changes of Fv/Fm, Ψo, ABS/CSm and PIABS after treatment with time (A) and RWC (B) of the leaves.The values of Fv/Fm and Ψo before treatment were taken as 100%, and the Fv/Fm and Ψo after treatment were converted into percentages of the value of before treatment. Means ± SE of 10 replicates are presented

2.4 脫水對狗牙根葉片PSⅠ活性的影響

葉片820 nm光吸收技術廣泛應用于葉片PSI的活性研究中[9,12]。圖6A表明，在脫水初期即處理時間小于10 h時，PSI光化學活性維持在較高水平，隨后葉片PSI活性大幅下降，圖6B表明，從葉片RWC下降到60%之前， ΔI/Io幾乎不隨葉片RWC下降而變化，但葉片RWC小于60%時，PSI活性急劇下降。

為了闡明葉片脫水過程中兩個光系統(tǒng)之間的相互作用和光合電子傳遞鏈的變化，利用同時測定的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線和820 nm光吸收曲線，分析了在相同脫水狀態(tài)下，PSI和PSII光化學活性的相對變化。從圖6可以得出，在脫水過程中，PSII最大光化學效率Fv/Fm以及被PSII反應中心捕獲的能量進入電子傳遞鏈的概率Ψo逐漸下降，但是下降程度較小，當PSII光化學活性仍處于較高水平時，葉片PSI活性大幅下降。這說明，脫水脅迫對于狗牙根葉片光合機構PSI的破壞早于對PSII的破壞。

圖6 脫水處理不同時間后葉片ΔI/Io隨處理時間(A)、葉片相對含水量(B)的變化、Fv/Fm(C)和Ψo(D)的變化。處理前Fv/Fm，Ψo和ΔI/Io的值被作為100%，處理后的Fv/Fm，Ψo和ΔI/Io換算為處理前值的百分比。每個數(shù)據均為10次重復的平均值Fig.6 The activity of the PSI complex (ΔI/Io) in leaves under dehydration treatment for different time (A) and different RWC (B). The activity of the PSI complex (ΔI/Io) (C) and maximum quantum yield of PSII (Fv/Fm, A) (D). ΔI/Io and exciton efficiency of electron transport beyond B) in leaves under dehydration treatment. The initial value of ΔI/Io, Fv/Fm and ΨObefore treatment were taken as 100%, and those after treatment were calculated as percentages of the initial value. Means ± SE of 10 replicates are presented

3 討論

脫水對于葉片F(xiàn)v/Fm影響較小，但會引起PSI活性大幅下降，這表明狗牙根葉片PSI對于脫水脅迫更敏感，而脫水脅迫對于PSII最大光化學效率(Fv/Fm)影響較小，Georgieva等研究表明葉片PSII光化學活性對于脫水有一定的抗性[13]。Fv/Fm只表示PSII反映中心對吸收光能的捕獲效率，而并不能全面的反映整條電子傳遞鏈對于脅迫的響應。ABS/CSm反映了光合機構對于光能的吸收，脫水降低了葉片的ABS/CSm，這表明脫水改變了天線色素的結構或使天線降解。光合性能指數(shù)(PIABS=(RC/ABS)·[φPo/(1-φPo)]·[ψO/(1-ψO)])反映了整條光合電子傳遞鏈對光能的捕獲以及電子傳遞整個過程，更準確的反映了植物光合電子傳遞鏈的狀態(tài)[14]。在脫水初期，ABS/CSm，Ψo以及Fv/Fm 均無顯著下降，但PIABS卻顯著下降，隨著脫水程度的加重，ABS/CSm和Ψo下降程度都小于PIABS的下降程度。這表明脫水直接影響了狗牙根葉片光合機構的光合性能。

4 結論

干旱脫水脅迫導致狗牙根葉片光合機構數(shù)量以及活性下降，限制了葉片的光合作用，最終影響狗牙根的生長和發(fā)育。在狗牙根實際栽培生產過程以及抗旱品種的選育過程中，光合性能指數(shù)(PIABS)可以作為一種篩選指標，快速有效的反映干旱脅迫對于狗牙根葉片的影響。