5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株吞噬活性和活性氧自由基的影響

陳向齊，宋洪濤，陳勝平，林 兵，劉志宏，昊 霞，翁巧玲

痤瘡（acne）是一種慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于青少年，發(fā)病率高達(dá)70%～87%。痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，P.acnes）是引起痤瘡的主要病原體。該菌寄生于皮膚毛囊及皮脂腺，屬革蘭陽性厭氧短桿菌，一般情況下為皮膚正常菌群。當(dāng)青春期來臨時(shí)，毛囊口被角栓堵塞，而皮脂腺分泌功能更旺盛，局部厭氧條件、脂肪酸等成分助長了痤瘡丙酸桿菌的過度繁殖，從而使其致病。巨噬細(xì)胞是固有免疫的免疫效應(yīng)細(xì)胞中的一員，通過固有的模式識(shí)別受體對(duì)入侵的病原體的病原相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別，結(jié)合后將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB，啟動(dòng)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，表達(dá)趨化因子、細(xì)胞因子，如NO、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α，使巨噬細(xì)胞激活，發(fā)揮吞噬和殺傷活性[1]。巨噬細(xì)胞在先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答中起重要作用[2]。2004年Holland等[3]發(fā)現(xiàn)，無瘢痕傾向的痤瘡患者早期炎癥皮損中有大量CD4+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和朗格漢細(xì)胞等細(xì)胞浸潤，大量表達(dá)人類白細(xì)胞抗原，局部血管形成并表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子，在24 h到達(dá)高峰，然后消退。但5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（5-aminolevulinicacid photodynamic therapy，5-ALA-PDT）能否對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株的吞噬活性和活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生影響，本文進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下，將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7（購自上海細(xì)胞生物研究所）接種于培養(yǎng)皿中。隔天更換培養(yǎng)基，2～3 d進(jìn)行一次傳代處理，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 滅活細(xì)菌液的準(zhǔn)備 挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌（廣東省微生物研究所，ATCC6919）的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3 d，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)，以生理鹽水調(diào)配細(xì)菌濃度至1×108個(gè) /ml，95 ℃水滅活 15 min。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 空白組：單純RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)。模型組：按文獻(xiàn)[4]的方法，給予終濃度2.25×107個(gè)/ml濃度痤瘡丙酸桿菌滅活液刺激RAW264.7細(xì)胞（2.25×105個(gè)/ml）2 h。5-ALA-PDT處理組（試驗(yàn)組）：分3個(gè)濃度，分別為0.03、0.06、0.12 mmol/L。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次4個(gè)復(fù)孔，取均值。

1.2.3 中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬活性 RAW264.7細(xì)胞以 1×106個(gè)/ml鋪黑色 96孔板（100 μl），置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。除空白組外，其他組給予終濃度1×108個(gè)/ml細(xì)菌滅活液刺激2 h，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=100:1?，F(xiàn)配5-ALA液（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司），給予終濃度0.03、0.06、0.12 mmol/L給藥，空白組、模型組加等量的PBS液。每個(gè)濃度4 個(gè)重復(fù)孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。給予16 J/cm2的紅光照射。吸出舊的培養(yǎng)基，加入新的培養(yǎng)基100 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 h后取出。巨噬細(xì)胞的吞噬活性用中性紅法測(cè)定，吸出培養(yǎng)基，每孔加0.1%中性紅懸濁液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄去上清液，用200 μl PBS液沖洗未被吞噬的中性紅，重復(fù)3次。每孔加200 μl細(xì)胞裂解液醋酸-乙醇（1:1），靜置2 h，使細(xì)胞溶解，混勻后在酶標(biāo)儀上測(cè)定 540 nm處吸光度(A)，以無細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)液為調(diào)零對(duì)照。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度 RAW264.7細(xì)胞以 5×104個(gè) /ml鋪黑色 96孔板（100 μl），置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。除空白組外，其他組給予終濃度5×106個(gè)/ml濃度細(xì)菌滅活液刺激2 h，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=100:1。其余方法同中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。在待測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)基中加入二氫乙錠（dihydroethidium，DHE，上海西塘生物技術(shù)有限公司，最終濃度為10 μmol/L），在37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。用預(yù)熱（37℃）的PBS沖洗3次，每次1～2 min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光，并拍照。

1.2.5 活性氧自由基檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基熒光強(qiáng)度。各孔中加入1:1 000用無血清DMEM稀釋2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（dihydrochloride acetyl acid dichloride，DCFH-DA，上海Sigma公司）探針 30 μl（終濃度 10 μmol/L），在培養(yǎng)箱中孵育30 min后去除探針，用PBS沖洗3遍，徹底清除未結(jié)合的熒光探針。每孔加入無血清DMEM 100 μl，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在485 nm激發(fā)波長下，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（xˉ ±s）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)用Tambane's T2法，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-ALA-PDT對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組A值為0.72±0.02，模型組A值為1.06±0.03，0.03 mmol/L組A值為0.91±0.04，0.06 mmol/L組A值為0.89±0.02，0.12 mmol/L組A值為0.76±0.01，用LSD檢驗(yàn)，F(xiàn)=99.316，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組A值和空白組比較，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.06 mmol/L組和模型組比較，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.12 mmol/L組和0.03 mmol/L組比較，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1 ）。

2.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度

圖1 5-ALA-PDT對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

圖2 5-ALA-PDT處理對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

圖3 5-ALA-PDT對(duì)痤瘡丙酸桿菌刺激的RAW264.7細(xì)胞ROS的影響

熒光顯微鏡下顯示0.03 mmol/L 5-ALA處理組小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株有少量熒光，0.12 mmol/L5-ALA處理組熒光明顯增強(qiáng)，表明0.12 mmol/L 5-ALA處理組產(chǎn)生大量ROS（圖2）。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度可見：0.03 mmol/L組細(xì)胞內(nèi)只見少量微弱紅色熒光；0.12 mmol/L組細(xì)胞內(nèi)有大量紅色熒光 。

2.3 5-ALA-PDT對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株ROS的影響

空白組熒光強(qiáng)度為0.25±0.01、模型組0.27±0.02，0.03 mmol/L 組 1.32±0.29，0.06 mmol/L 組 1.82±0.32，0.12mmol/L組2.47±0.12，用Tambane's T2檢驗(yàn)F=94.865，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組和空白組比較，P=0.679，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.03 mmol/L組和空白組比較，P=0.026，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.12 mmol/L組和0.03 mmol/L組比較，P=0.012，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

3 討論

光動(dòng)力學(xué)療法（PDT）作為光療法的分支，是一種新興療法，用于治療痤瘡療效顯著，不良反應(yīng)小，已成為目前的研究熱點(diǎn)[2,4]。其作用機(jī)制是在患處應(yīng)用光敏劑，在光照的基礎(chǔ)上，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)，從而治愈疾病。以光敏劑5-ALA為例，5-ALA經(jīng)上皮細(xì)胞及毛囊皮脂腺吸收后，可以通過血紅素合成途徑代謝為原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ），當(dāng)光線照射時(shí)，PpⅨ受激發(fā)產(chǎn)生單態(tài)氧和自由基，使得細(xì)胞凋亡，皮脂腺萎縮，痤瘡丙酸桿菌被殺滅[5,6]。

巨噬細(xì)胞對(duì)異物，如細(xì)菌等有吞噬和消化的功能，在非特異性免疫反應(yīng)中起重要作用，中性紅法可用來檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。筆者的研究結(jié)果表明，用痤瘡丙酸桿菌刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞后吞噬活性增強(qiáng)，給予不同濃度5-ALA-PDT處理后吞噬活性均降低，隨著濃度升高，吞噬活性降低更明顯，呈劑量依賴性。表明 5-ALA-PDT能減輕小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株吞噬活性，可能減輕痤瘡的炎癥反應(yīng)。

ROS是生物體內(nèi)含有氧原子和活性物質(zhì)的總稱。除了機(jī)體的正常代謝能產(chǎn)生ROS外，免疫反應(yīng)和抗生素等均可導(dǎo)致ROS水平升高。由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的ROS可直接殺死病原微生物，起到免疫防御作用。熒光顯微鏡能直接觀察到ROS的強(qiáng)度，熒光酶標(biāo)儀能定量檢測(cè)ROS水平。在熒光顯微鏡下觀察到小鼠RAW264.7細(xì)胞株ROS變化情況：正常情況下小鼠巨噬細(xì)胞264.7細(xì)胞株ROS水平低，不易觀察到，5-ALA-PDT有效增加痤瘡丙酸桿菌感染后細(xì)胞內(nèi)ROS水平，隨著5-ALA濃度升高，ROS水平持續(xù)升高，呈劑量依賴性?？赡苁?-ALAPDT治療后產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，使ROS水平上升，將痤瘡丙酸桿菌殺死，從而治療痤瘡。下一步研究可檢測(cè)不同處理組單線態(tài)氧等不同ROS成分水平，進(jìn)一步研究5-ALA-PDT對(duì)ROS的影響。