澤漆水煎劑體外抑菌的療效作用研究※

● 郁 利 吳昆侖 都樂(lè)亦 葉 璐▲

中藥澤漆是指大戟科二年生草本植物澤漆(Euphorbia helioscopia L.)的全草，別名桼莖、貓兒眼睛草、綠葉綠花草等，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，尤以江浙一帶產(chǎn)量較多。出于《本經(jīng)》，其性味苦，微寒，功效除能利水、化痰、散結(jié)外，還能殺蟲(chóng)[1]。

筆者與上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院中醫(yī)科的吳昆侖主任合作，對(duì)澤漆單味藥物進(jìn)行深入的研究，前期應(yīng)用其水煎劑治療慢性牙周炎、復(fù)發(fā)性口瘡、護(hù)理臥床住院病人口腔，均取得良好的療效[2,3]，為了進(jìn)一步明確澤漆水煎劑的治療作用是否是通過(guò)對(duì)口腔常見(jiàn)細(xì)菌的抑制，進(jìn)行了如下體外試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1一般材料選擇口腔常見(jiàn)菌種15種：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、乙型溶血性鏈球菌(β hemolytic streptococcus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色念珠菌(Candida albicans)、粘性放線菌(Actinomyces viscosus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、大腸埃希菌(E.coli)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、沙雷菌(Shewanella oneidensis)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、卟啉單胞菌(Porphyromonsginglivlis)、梭形桿菌(Fusiform bacillus)和中間普雷沃菌(Prevotella intermedia)

實(shí)驗(yàn)藥物為澤漆水煎液，單味澤漆(產(chǎn)地安徽，上海萬(wàn)仕誠(chéng)國(guó)藥制品有限公司，批號(hào)20170326-1)，制備工藝為：10倍量的蒸餾水，浸泡60min，煮沸后煎煮15min，過(guò)濾藥液。于設(shè)定溫度為4℃的冰箱內(nèi)冷藏備用，存放時(shí)間小于14天。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們將澤漆水煎原液分別稀釋1倍和4倍，制備成低、中、高三個(gè)濃度梯度。陽(yáng)性對(duì)照藥物為復(fù)方氯己定含漱液(國(guó)藥準(zhǔn)字H10920104，深圳南粵藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，陰性對(duì)照為生理鹽水。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌菌液的配置 將供試菌種移接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基[胰蛋白胨10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，氯化鈉(NaCl)10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH7.4～7.6]上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，菌液濃度為2×108CFU/ml，4°C冷藏備用。

1.2.2 真菌菌液的配置 將真菌接種在培養(yǎng)基(蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，蒸餾水1000mL，pH6.2～6.6)上，28°C培養(yǎng)1～4天，菌液濃度為2×108CFU/ml，4°C冷藏備用。

1.2.3 檢測(cè)方法 采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行檢測(cè)。將菌液均勻涂在直徑為9cm的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，把直徑為6mm的濾紙片(吸液量20μl)貼于該培養(yǎng)基上，中央1個(gè)，周圍4個(gè)，濾紙片分別用澤漆水煎液(低、中、高三個(gè)濃度梯度)、復(fù)方氯己定含漱液和生理鹽水浸透，在微需氧環(huán)境培養(yǎng)3天后觀察結(jié)果。所有體外抑菌實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 以抑菌直徑>10mm為高度敏感，7mm<抑菌直徑≤10mm為中度敏感，2mm<抑菌直徑≤7mm為低度敏感，抑菌直徑≤2mm為不敏感。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05則表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1澤漆水煎劑與復(fù)方氯己定含漱液的體外抑菌效果二者均具有低度敏感的抑菌作用。在同一細(xì)菌培養(yǎng)基中，觀察了三個(gè)濃度梯度的澤漆水煎劑和復(fù)方氯己定含漱液(陽(yáng)性對(duì)照)的抑菌效果，結(jié)果顯示澤漆水煎劑與復(fù)方氯己定含漱液均具有低度敏感的抑菌作用。見(jiàn)圖1。

圖1 澤漆水煎劑和復(fù)方氯己定含漱液的體外抑菌效果典型圖

注：5個(gè)濾紙片，中央1個(gè)，周圍4個(gè)。中央1個(gè)為生理鹽水陰性對(duì)照，無(wú)藥物擴(kuò)散而顏色最淺的為陽(yáng)性藥對(duì)照(9點(diǎn))。澤漆水煎劑濃度梯度依次為低濃度(0點(diǎn))，中濃度(3點(diǎn))，高濃度(6點(diǎn))。

表1 濃度梯度澤漆水煎劑對(duì)15種口腔常見(jiàn)菌種的抑菌作用

注：與復(fù)方氯己定含漱液(陽(yáng)性對(duì)照組)相比較，aP<0.05；與中、高濃度澤漆水煎劑相比較，bP<0.05；與低、高濃度澤漆水煎劑相比較，cP<0.05；與低、中濃度澤漆水煎劑相比較，dP<0.05

2.2三種濃度澤漆水煎劑抑菌效果比較不同濃度梯度澤漆水煎劑對(duì)不同的菌種抑菌效果不同。低濃度對(duì)需氧菌種的金色黃葡萄球菌(P<0.05)和白色念珠菌(P<0.05)具有較好的抑菌作用，中濃度對(duì)銅綠假單胞菌(P<0.05)和兩歧雙歧桿菌(P<0.05)抑制效果較好，而高濃度對(duì)需氧菌種的乙型溶血性鏈球菌(P<0.05)和大腸埃希菌(P<0.05)的抑制效果較好。見(jiàn)表1。

2.3與復(fù)方氯己定含漱液的抑菌效果比較與復(fù)方氯己定含漱液相比較，低濃度的澤漆水煎劑對(duì)金色黃葡萄球菌(P<0.05)和白色念珠菌(P<0.05)、中濃度的澤漆水煎劑對(duì)兩歧雙歧桿菌(P<0.05)以及高濃度的澤漆水煎劑對(duì)乙型溶血性鏈球菌(P<0.05)和大腸埃希菌(P<0.05)的抑菌效果均優(yōu)于復(fù)方氯己定含漱液。對(duì)銅綠假單胞菌和中間普雷沃菌的抑菌效果與復(fù)方氯己定含漱液相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

慢性口腔感染如慢性牙周炎等是常見(jiàn)病多發(fā)病，在我國(guó)的患病率占到70%以上[4]，當(dāng)前的主要治療方案是通過(guò)潔治術(shù)清除菌斑和牙石，但是對(duì)于炎癥較重的患者仍需要局部的藥物治療，如復(fù)方氯己定含漱液，甚至有些患者需要全身抗生素的使用[5]。無(wú)論全身還是局部，長(zhǎng)時(shí)間使用抗生素易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥。因此筆者積極探尋中醫(yī)藥療法。

吳昆侖主任的導(dǎo)師善用澤漆內(nèi)服治療咳喘病。在對(duì)澤漆進(jìn)行深入研究后，吳主任發(fā)現(xiàn)《本草綱目》中提到：“牙痛。用澤漆研為末，開(kāi)水泡汁漱口。”[6]繼而嘗試將之應(yīng)用于治療慢性牙周炎、復(fù)發(fā)性口瘡，護(hù)理住院臥床病人口腔等領(lǐng)域，均取得了較好的療效。

慢性牙周炎的使動(dòng)因子是牙菌斑的堆積，復(fù)發(fā)性口瘡存在口腔感染的因素[7]，臥床住院病人也需要保持口腔清潔，預(yù)防感染?，F(xiàn)代藥理研究亦顯示澤漆有抑菌作用。因而筆者與吳昆侖主任一同對(duì)澤漆水煎劑體外抑制口腔細(xì)菌的種類進(jìn)行了探索。

本研究選取15種口腔內(nèi)常見(jiàn)的細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示不同濃度澤漆水煎劑對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、兩歧雙歧桿菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌具有良好的抑菌作用，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)藥物復(fù)方氯已定。在免疫力低下以及糖尿病、腫瘤和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者中更易發(fā)生金黃色葡萄球菌和白色念珠菌導(dǎo)致的口腔和齒齦感染[8-11]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌和正畸白斑的發(fā)生有一定因果關(guān)系[12]。此外，乙型溶血性鏈球菌是感染性心內(nèi)膜炎的致病菌，長(zhǎng)期的口腔鏈球菌感染是感染性心內(nèi)膜炎復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素[13]。中間普雷沃菌亦被認(rèn)為是慢性牙周炎相關(guān)的致病微生物[14]。

從本研究結(jié)果可以看出，澤漆水煎劑對(duì)口腔常見(jiàn)細(xì)菌，具有廣譜的抑菌效果，并確有可能通過(guò)抑制口腔常見(jiàn)感染菌群的生長(zhǎng)來(lái)達(dá)到治療效果。

澤漆水煎劑的抑菌機(jī)制目前尚不完全清楚，已有的研究發(fā)現(xiàn)大戟科藥物尤其是澤漆中有效成分假白欖烷類具有抑菌作用[15]，也有研究報(bào)道1-ethoxypentacosane， heptacosan-1-ol 和β-谷甾醇可能是抑菌的主要成分[16]。澤漆抑菌的確切藥理作用有待進(jìn)一步深入研究。

筆者在臨床應(yīng)用澤漆水煎劑治療口腔疾病，的確取得了較好的療效，但本實(shí)驗(yàn)中澤漆對(duì)細(xì)菌的敏感性不高，可能有以下原因：①本研究采用的紙片擴(kuò)散法(K-B法)是體外抑菌試驗(yàn)中最常用的方法。澤漆水煎劑為懸濁液，成分較為復(fù)雜，其中的抑菌活性成分可能存在具揮發(fā)性、對(duì)熱敏感，導(dǎo)致藥物揮發(fā)等因素很可能影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性。②口腔微生物極為豐富，有研究者發(fā)現(xiàn)涵蓋了22個(gè)細(xì)菌門的318個(gè)細(xì)菌屬[17]，本研究?jī)H選取了常見(jiàn)的15種常見(jiàn)口腔致病菌進(jìn)行研究，可能與澤漆水煎劑實(shí)際的抑菌譜尚存在一定差異。下一步，筆者將對(duì)澤漆水煎劑進(jìn)行稀釋法定量測(cè)定，進(jìn)一步闡明澤漆水煎劑的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，評(píng)估其抑菌性能，并深入探究澤漆的抑菌機(jī)制研究。