RAGE基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)性研究

胡靜濤，李艷茹

作者單位：1 462300 漯河,河南省漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。珻HD）是冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)大量堆積形成斑塊引發(fā)的一種嚴(yán)重危害人類身體健康和生活質(zhì)量的動(dòng)脈粥樣硬化性病變，其發(fā)病率和致死率一直居高不下，被稱為威脅人類健康的“第一殺手”[1]。因此，對(duì)于防治CHD的發(fā)生和發(fā)展是一項(xiàng)長(zhǎng)期且艱巨的任務(wù)。迄今為止，CHD的相關(guān)機(jī)制尚待探討，但是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)被普遍認(rèn)為是大多數(shù)心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)[2]。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）在引起炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用[3]。RAGE通過(guò)與晚期糖基化終產(chǎn)物，S100/鈣粒蛋白等多種相關(guān)配體結(jié)合，刺激細(xì)胞因子和炎性因子釋放，導(dǎo)致血管通透性異常，損傷血管內(nèi)皮功能，從而引發(fā)AS的發(fā)生[4]。近幾年，隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，從遺傳學(xué)角度探討基因突變與CHD發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性已經(jīng)成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但是目前為止，尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn)某個(gè)基因突變與CHD的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)?？紤]到RAGE特殊的結(jié)構(gòu)特征，在啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子均存在眾多的單核苷酸多態(tài)性（SNPs），從而調(diào)控RAGE參與不同的信號(hào)通路促使動(dòng)脈粥樣硬化的加速損傷[5]。但是目前國(guó)外關(guān)于RAGE基因多態(tài)性與CHD發(fā)病和嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究尚少且存在一定的爭(zhēng)議性，本項(xiàng)研究旨在探討RAGE基因多態(tài)性與我國(guó)漢族人群冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 入組患者 本項(xiàng)研究回顧性分析了2016年1月～2017年10月于漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院的397例CHD患者，其中男性238例，女性159例，年齡為39～81歲，平均年齡為（63.67±13.19）歲。所有患者經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為CHD，并根據(jù)造影結(jié)果分為冠狀動(dòng)脈輕中度狹窄（管徑狹窄＜75%）組（n=185例）和重度狹窄（管徑狹窄≥75%）組（n=212例）。另外，選取同時(shí)期在我院體檢中心進(jìn)行健康體檢的正常志愿者48例，其中男性27例，女性21例，年齡為50～72歲，平均年齡為（62.28±12.74）歲。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 CHD患者 ①所有患者接受冠狀動(dòng)脈造影檢查；②均符合《冠心病診斷與治療指南（2014版）》關(guān)于CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③患者自愿，并簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 非CHD受試者 ①經(jīng)健康體檢、實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖檢查、胸片、核素心肌灌注顯像、冠狀動(dòng)脈CT成像（CTA）排除CHD、高血壓等心血管疾?。虎跓o(wú)家族性高血壓史、心腦血管疾病史；③簽署知情同意書(shū)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的受試者；②合并惡性腫瘤者；③合并器質(zhì)性心臟病變者；④合并有血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病或者急性感染者；⑤合并其他嚴(yán)重疾病者。

1.4 樣本采集 采集所有受試者清晨空腹時(shí)的外周靜脈血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二鈉（EDTA-Na）抗凝劑的采血管中，用于檢測(cè)生化指標(biāo)；其余血液樣本于-70℃低溫保存，用于進(jìn)行DNA提取。

1.5 研究方法

1.5.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 由漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科采用邁瑞B(yǎng)S350全自動(dòng)血液生化分析儀（中國(guó)邁瑞）檢測(cè)患者血糖、血脂等生化指標(biāo)。另外由心電圖科室采用GE MAC1200心電圖監(jiān)護(hù)儀（美國(guó)通用公司）進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），二尖瓣血流E峰和A峰流速比值（MVE/MVA），左心室收縮期內(nèi)徑（LVIDs），左心室舒張期內(nèi)徑（LVIDd）。

1.5.2 冠狀動(dòng)脈造影 由2位介入專家進(jìn)行操作，并判斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度：左主干、左前降支、回旋支和右冠狀動(dòng)脈及主要分支中出現(xiàn)1支以上血管狹窄程度≥50%的情況。冠狀動(dòng)脈管徑狹窄＜75%者為輕中度狹窄；管徑狹窄≥75%為重度狹窄。

1.5.3 引物設(shè)計(jì)與合成方法 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的資料設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。RNGE啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子基因SNPs分析（表1）。

1.5.4 RAGE基因多態(tài)性檢測(cè)方法 ①DNA提?。翰捎没蚪MDNA小量抽提試劑盒（由北京天根生物技術(shù)有限公司提供）。具體提取方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。②采用紫外分光光度法測(cè)定DNA質(zhì)量和濃度。③進(jìn)行PCR-RFLP：取8 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μl 10×Buffer和1ul特異性限制性內(nèi)切酶（購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司），然后加入9 μl去離子水，于37℃反應(yīng)12～14 h。④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。⑤基因測(cè)序：將50 μl測(cè)序樣品送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化測(cè)序；確定為目的片段后，進(jìn)行大批量擴(kuò)增，電泳，酶切，確定基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。每一等位基因出現(xiàn)的頻率采用直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)算；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的數(shù)據(jù)比較；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用Logistic多元回歸分析確定RAGE基因多態(tài)性與冠脈病變的關(guān)系。根據(jù)樣本方差，采用相應(yīng)的t值或P值；以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組受試者一般臨床資料比較 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，三組受試者年齡、飲酒史、總膽固醇水平、LVEF、LVIDs、LVIDd比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05；但是有吸煙史、糖尿病史、阿司匹林服用史、降壓藥服用史的CHD患者比例明顯高于非CHD受試者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。另外，CHD患者收縮壓、舒張壓、三酰甘油、空腹血糖值明顯高于非CHD受試者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05（表2）。

表1 RNGE啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子基因SNPs分析

2.2 各組之間TNF-α-238基因型及等位基因分布頻率比較 對(duì)照組受試者、冠脈狹窄輕中度組和重度組患者RAGE基因啟動(dòng)子區(qū)-429T/C多態(tài)性基因分布頻率分別為（83.33%TT，14.58%TC，2.08%CC），（77.3%TT，22.7%TC），（74.53%TT，25.47%TC），其中以TT型為最多見(jiàn)。對(duì)照組受試者、冠脈狹窄輕中度組和重度組患者RAGE基因外顯子區(qū)1704G/T多態(tài)性基因分布頻率分別為（64.58%GG，29.17%GT，6.25%TT），（65.95%GG，27.03%GT，7.03%TT），（66.04%GG，29.72%GT，4.25%TT），其中以GG型為最多見(jiàn)。三組之間-429T/C和1704G/T多態(tài)性的基因型和等位基因頻率分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。對(duì)照組受試者、冠脈狹窄輕中度組和重度組患者RAGE基因內(nèi)含子區(qū)G82S多態(tài)性基因分布頻率分別為（75.0%GG，22.92%GS，2.08%SS），（62.7%GG，36.22%GS，1.08%SS），（52.83%GG，36.79%GS，10.38%SS），其中以GG型為最多見(jiàn)。等位基因頻率分別為（87.5%G，12.5%S），（80.81%G，19.19%S），（71.93%G，28.07%S），其中以等位基因G為最多見(jiàn)。三組受試者中三種基因型及G、S等位基因的頻率分布存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05（表3）。

2.3 各組受試者RAGE基因單倍體型分布頻率 由RAGE基因-429T/C、1704G/T和G82S多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建單倍體，經(jīng)PHASE2.0軟件檢測(cè)，G-Gly-T、G-Gly-C、G-Ser-T、T-Gly-T四個(gè)單倍體頻率＞5%。對(duì)照組受試者、冠脈狹窄輕中度組和重度組患者中這四對(duì)單倍體型的分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。其中對(duì)照組受試者G-Gly-T單倍體分布頻率高于其他兩組CHD患者，而重度冠脈狹窄組患者G-Ser-T單倍體分布頻率高于其他兩組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05（表4）。

表2 各組患者臨床基線資料比較

表3 RNGE基因多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布（n，%）

2.4 RAGE基因單倍體型與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性 單倍體G-Ser-T與冠狀動(dòng)脈發(fā)生重度狹窄有明顯的正相關(guān)性（OR值為1.984，95%CI為1.241～2.955，P=0.014＜0.05）。提示單倍體G-Ser-T可明顯增加冠狀動(dòng)脈發(fā)生狹窄的風(fēng)險(xiǎn)，P＜0.05。未發(fā)現(xiàn)其他單倍體與冠狀動(dòng)脈狹窄存在相關(guān)性，P＜0.05（表5）。

3 討論

目前，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病已經(jīng)成為全球性問(wèn)題。進(jìn)入本世紀(jì)以來(lái)，隨著我國(guó)老齡化問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，冠心病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅到國(guó)民尤其是老年人群的生命健康和生活質(zhì)量。CHD的發(fā)病因素多樣化，包括年齡、性別、飲酒史、糖尿病史等都是常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素[7]。本項(xiàng)研究也分析了影響CHD發(fā)生的相關(guān)因素，其中男性較女性發(fā)病率高，有吸煙史者、合并糖尿病、高血壓者CHD的發(fā)病率升高。在我國(guó)通常將阿司匹林、鈣離子阻滯劑、β受體拮抗劑、他汀類降壓藥物等作為CHD的二級(jí)預(yù)防方案。但本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，未給予二級(jí)預(yù)防治療的冠心病患者，其發(fā)病率并沒(méi)有得到有效控制。

CHD的發(fā)病機(jī)制一直是心血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，但是尚未明確；多項(xiàng)研究證實(shí)，由動(dòng)脈粥樣硬化引起的全身慢性炎癥反應(yīng)是CHD重要的發(fā)病基礎(chǔ)之一[8]。RAGE作為免疫球蛋白超家族成員之一，與相關(guān)配體在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)激活多種信號(hào)通路，激活核轉(zhuǎn)錄因子，促使炎性因子、粘附分子以及趨化因子的分泌增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮發(fā)生炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮功能和血管內(nèi)皮的通透性，進(jìn)一步影響脂質(zhì)代謝，促使心肌細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)心血管粥樣硬化性病變[9,10]。因此RAGE基因一直被認(rèn)為是心血管疾病遺傳易感性的重要基因[11]。

近些年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是基因組計(jì)劃和后基因組計(jì)劃研究工作的深入開(kāi)展，為探討冠心病發(fā)生發(fā)展的遺傳學(xué)機(jī)制提供了新的思路和方法。通過(guò)對(duì)相關(guān)基因多態(tài)性的研究，有可能為我們從基因水平上認(rèn)識(shí)CHD的發(fā)病機(jī)制提供了新的依據(jù)。上個(gè)世紀(jì)末，由Hudson等[12]學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)RAGE配體結(jié)合域存在功能性氨基酸變異現(xiàn)象，可激活配體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而認(rèn)為RAGE基因關(guān)鍵區(qū)域的基因多態(tài)性可能會(huì)影響基因表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致不同的作用反應(yīng)[13]。有研究證實(shí)，RAGE G8S2突變位點(diǎn)與阿爾茲海默病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、銀屑病等多種疾病的遺傳易感性密切相關(guān)[14,15]?；谇捌趫?bào)道，本項(xiàng)研究著重探討了EAGE基因多態(tài)性與CHD患者冠脈病變程度的相關(guān)性。結(jié)果顯示，攜帶有RAGE基因G82S多態(tài)性的單倍體型發(fā)生冠狀動(dòng)脈重度狹窄的危險(xiǎn)性顯著增加。其可能的作用機(jī)制與RAGE S等位基因的配體結(jié)合親和力強(qiáng)于G等位基因有關(guān)，可進(jìn)一步促使血管內(nèi)皮發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。但是，本項(xiàng)研究未發(fā)現(xiàn)，其他RAGE單倍體型與冠狀動(dòng)脈狹窄存在明顯的相關(guān)性。這可能與種族、地域以及樣本納入量較少有關(guān)。

由于冠心病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且與遺傳因素密切相關(guān)，不同的種族、地區(qū)的人群基因背景也不甚相同，因此RAGE基因多態(tài)性在冠心病的發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程中是否發(fā)揮重要作用，還尚待進(jìn)一步確證。本研究在一定程度上反映了攜帶有RAGE基因G82S多態(tài)性的單倍體型人群發(fā)生冠狀動(dòng)脈重度狹窄的危險(xiǎn)性顯著增加，是發(fā)生冠脈嚴(yán)重狹窄的一項(xiàng)重要危險(xiǎn)因素，為冠心病的預(yù)防和基因治療提供了一定的證據(jù)支持。

表4 各組受試者RAGE基因單倍體型分布頻率[n(%)]

表5 經(jīng)Logistic多元回歸分析RAGE基因單倍體型與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的相關(guān)性