miR-499、miR-146a在急性冠脈綜合征患者中的表達(dá)水平以及與冠脈病變程度的相關(guān)性

陳晨，周剛，曹麗萍

作者單位：1 621900 綿陽(yáng),四川省科學(xué)城醫(yī)院心內(nèi)科

近幾年，隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加快，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┑陌l(fā)病率逐年上升，急性冠脈綜合征（ACS）屬于冠心病的一種危急重癥，致死率較高[1]。目前，臨床上關(guān)于ACS的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，根據(jù)患者不同的心肌缺血程度和側(cè)支循環(huán)形成速度，表現(xiàn)出不同的臨床癥狀[2]。因此如何準(zhǔn)確判斷血管病變程度，進(jìn)行合理的分層治療，對(duì)于提高治療效果、降低醫(yī)療資源浪費(fèi)具有十分重要的臨床價(jià)值。目前冠狀動(dòng)脈（冠脈）造影（CAG）是臨床上用于診斷冠心病及客觀評(píng)價(jià)冠脈狹窄程度的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但是價(jià)格昂貴、屬于侵入性操作，而很多生化標(biāo)志物的敏感性較低，因此尋找新的特異性指標(biāo)對(duì)冠脈狹窄程度進(jìn)行客觀評(píng)估對(duì)于進(jìn)行個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。隨著RNA組學(xué)研究的深入，臨床上逐漸關(guān)注miRNAs作為新的心血管疾病診斷和治療標(biāo)志物的潛力[4]。基于前期調(diào)查和研究，篩選與血管壁內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)的miR-499、miR-146a作為候選標(biāo)志物，探討miRNAs對(duì)冠脈狹窄程度的潛在診斷價(jià)值?，F(xiàn)研究報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組 連續(xù)入選2016年5月～2017年12月于四川省科學(xué)城醫(yī)院心內(nèi)科住院接受治療的ACS患者139例，其中男性74例，女性65例，年齡為39～81（61.58±7.32）歲?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者經(jīng)CAG、臨床癥狀以及輔助檢查確診為ACS[5]。②具有完整的臨床資料；③由患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的患者；②受試前1個(gè)月接受過溶栓、抗凝、抗血小板藥物治療者；③受試前1個(gè)月接受過激素、非甾體類抗炎藥物、阿片受體激動(dòng)劑等治療者；④治療前出現(xiàn)嚴(yán)重的意識(shí)障礙、高血壓危象、急性心衰等患者；⑤合并先天性心臟病、風(fēng)濕性心肌炎、病毒性心肌炎者；⑥合并嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、急慢性嚴(yán)重感染、嚴(yán)重出血傾向者；⑦合并嚴(yán)重的肝腎功能損傷、惡性腫瘤者。根據(jù)ACS患者臨床表現(xiàn)，心電圖變化等，將ACS患者又分為兩個(gè)亞組，包括急性心肌梗死（AMI）（n=68例）和不穩(wěn)定型心絞痛（UA）（n=71例）。另外選擇同時(shí)期在我院因相同的胸痛癥狀就診，進(jìn)行CAG檢查未發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常，心肌酶和心肌肌鈣蛋白檢查呈陰性的42例受試者作為對(duì)照組納入本項(xiàng)研究。本項(xiàng)研究已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動(dòng)脈造影術(shù)（CAG） 患者在檢查前，適度放松手腕，自橈骨莖突上2 cm處行穿刺，經(jīng)鞘管注射3000～6000 U肝素，對(duì)左右冠狀動(dòng)脈進(jìn)行全方位拍片檢查，采用DSA圖像處理系統(tǒng)定量分析冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)和狹窄程度。

1.2.2 病變支數(shù) ①單支病變：左冠狀動(dòng)脈的左前降支（LAD）、左回旋支（LCX）、右冠狀動(dòng)脈（RCA）中任一單支血管狹窄＞50%。②雙支病變：LAD、LCX、RCA中任意兩單支血管狹窄>50%或者左主干（LM）病變。③三支病變：LAD、LCX、RCA均狹窄，或者LM合并RCA同時(shí)病變。

1.2.3 冠狀動(dòng)脈病變程度 采用Gensini評(píng)分系統(tǒng)來評(píng)價(jià)：1分，狹窄＜25%；2分，25%～50%狹窄；4分：51%～75%狹窄；8分：76%～90%狹窄；16分：91%～99%狹窄；32分，100%狹窄。冠狀動(dòng)脈個(gè)段所占的系數(shù)：LM×5；前降支近、中、遠(yuǎn)段分別×2.5、×1.5、×1；第一及第二對(duì)角支分別×1、×0.5；回旋支近、中、遠(yuǎn)段分別×2.5、×1.5、×1；右冠狀動(dòng)脈近段、中段、遠(yuǎn)段、后降支、左室后支分別×1，所有病變得分相加為最后總分。根據(jù)Gensini評(píng)分，0～30分定義為輕度病變，31～60分定義為中度病變，＞60分定義為重度病變。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè) 所有受試者入院后24 h內(nèi)采集空腹肘靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管（法國(guó)Becton Dickinson公司提供）中。將血液樣本于室溫下離心300 g×10 min，取上清，邁瑞B(yǎng)S-350型全自動(dòng)生化分析儀（中國(guó)邁瑞公司提供）檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)（PLT）、心肌肌鈣蛋白（cTnI）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.2.5 miRNA的檢測(cè)

1.2.5.1 血小板提取和純化 ①將血液樣本室溫下160 g離心6 min，取中層上清液，約3 mm，即為富含血小板血漿；②將富含血小板血漿置于離心管中，加入等體積的改良HEPES臺(tái)式液，室溫下300 g離心10 min，棄上清；③加入3 ml改良HEPES臺(tái)式液重懸，離心，棄上清，重復(fù)三次，收集血小板球；④采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板純度。

1.2.5.2 血小板RNA提取 ①收集血小板1×1010個(gè)，置于EP管中；②按照Ambion RNA提取分離試劑盒（日本Takara公司提供）說明書步驟進(jìn)行操作。③將提取的RNA溶液分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。④采用凝膠電泳檢測(cè)RNA分子量；采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

1.2.5.3 RNA反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司提供）說明書操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）采用CFX-96-C1000 real-time PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司提供）按照三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用miRNA PCR Array Data Analysis Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 兩組患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、糖尿病史、高血壓病史、高脂血癥史、吸煙史基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05，表1）。

2.2 兩組患者生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 比較兩組受試者入院時(shí)血液生化指標(biāo)，結(jié)果顯示，ACS患者PLT、cTnI含量高于對(duì)照組受試者，統(tǒng)計(jì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均＜0.05；兩組受試者其他各項(xiàng)指標(biāo)包括FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P均＞0.05（表2）。

2.3 受試者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況及Gensini評(píng)分比較 ACS患者中，UA組和AMI組的血小板miR-499、miR-146a相對(duì)表達(dá)值以及Gensini評(píng)分均高于對(duì)照組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均＜0.05。同時(shí)，AMI組患者血小板miR-499、miR-146a相對(duì)表達(dá)值及Gensini評(píng)分均高于UA患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均＜0.05（表3）。

2.4 不同病變支數(shù)ACS患者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況比較 三支病變的ACS患者血小板miR-499、miR-146a相對(duì)表達(dá)值以及Gensini評(píng)分最高，與其他兩個(gè)亞組患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。說明病變血管越多，Gensini評(píng)分越高，血小板miR-499、miR-146a相對(duì)表達(dá)水平也越高（表4）。

2.5 不同冠脈病變程度ACS患者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況比較 冠脈病變程度越高，血小板miR-499、miR-146a表達(dá)水平越高，三個(gè)不同冠脈病變程度亞組患者，血小板miR-499、miR-146a相對(duì)表達(dá)值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05（表5）。

表1 患者的一般臨床資料分析

表2 兩組受試者入院時(shí)檢查結(jié)果比較（±s）

表2 兩組受試者入院時(shí)檢查結(jié)果比較（±s）

注：ACS：急性冠脈綜合征；PLT：血小板計(jì)數(shù)；cTnI：心肌肌鈣蛋白；FPG：空腹血糖； TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=42） ACS組（n=139） P值PLT（×109/L） 169.45±31.74 227.15±65.89 0.000 cTnI（μg/l） 0.17±0.42 6.93±10.85 0.000 FPG（mmol/l） 5.38±1.45 5.77±1.21 0.083 TG（mmol/l） 1.85±1.09 1.97±1.14 0.547 TC（mmol/l） 4.12±1.44 4.58±1.65 0.105 HDL-C（mmol/l） 1.47±0.17 1.40±0.24 0.080 LDL-C（mmol/l） 2.35±0.25 2.46±0.34 0.054

表3 兩組受試者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況和Gensini評(píng)分比較（±s）

表3 兩組受試者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況和Gensini評(píng)分比較（±s）

注：ACS：急性冠脈綜合征；UA：不穩(wěn)定心絞痛；AMI：急性心肌梗死；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與UA組比較，bP＜0.05

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=42） UA（n=71） AMI（n=68）miR-499/β-actin1.01±0.18 1.43±0.17a1.95±0.14ab miR-146a/β-actin0.79±0.09 0.93±0.15a1.27±0.22ab Gensini評(píng)分 15.41±0.25 48.59±12.47a57.94±13.26ab

2.6 血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況與Gensini評(píng)分相關(guān)性分析 采用Pearson相關(guān)性分析，ACS患者Gensini評(píng)分與血小板miR-499、miR-146a表達(dá)呈正相關(guān)性，r分別為0.785，0.806，P均＜0.05，（表6，圖1）。

3 討論

冠心病是全球包括我國(guó)致死率最高的心腦血管疾病之一，近些年發(fā)病人數(shù)逐年上升呈年輕化趨勢(shì)，給患者家庭和社會(huì)醫(yī)療增加極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。ACS屬于冠心病最嚴(yán)重、最復(fù)雜的危急重癥[6]。多項(xiàng)研究證實(shí)，冠脈形成不穩(wěn)定的硬化斑塊，斑塊破裂、鈣化、糜爛等導(dǎo)致冠脈腔狹窄與ACS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要由兩部分組成，包括膠原纖維帽和富含脂質(zhì)的脂質(zhì)核心[8]。膠原纖維帽可穩(wěn)定斑塊，而脂質(zhì)核心是由巨噬細(xì)胞吞噬大量LDL-C后，導(dǎo)致溶酶體破裂最終引起斑塊破裂[9]。斑塊一旦破裂，血小板迅速聚集形成白色血栓，通常表現(xiàn)為非ST段持續(xù)抬高心肌梗死；若斑塊破裂嚴(yán)重，則會(huì)大量黏附纖維蛋白形成紅色血栓，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈完全閉塞，形成ST段持續(xù)抬高型心肌梗死[10]。因此血小板是影響這一系列病理過程的關(guān)鍵因素，不僅可以釋放大量細(xì)胞因子參與ACS的發(fā)生和發(fā)展；同時(shí)也可作為炎性細(xì)胞激活或釋放炎性因子參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成[11]。

表4 不同病變支數(shù)ACS患者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況和Gensini評(píng)分比較（±s）

表4 不同病變支數(shù)ACS患者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況和Gensini評(píng)分比較（±s）

注：與單支病變亞組比較，aP＜0.05；與雙支病變亞組比較，bP＜0.05

三支病變亞組（n=49）miR-499/β-actin1.32±0.18 1.75±0.23a2.08±0.26ab miR-146/β-actin0.84±0.12 0.96±0.20a1.33±0.17ab Gensini評(píng)分 34.23±9.7550.42±12.64a63.78±10.39ab項(xiàng)目 單支病變亞組（n=37）雙支病變亞組（n=53）

表5 不同冠脈病變程度ACS患者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況（±s）

表5 不同冠脈病變程度ACS患者血小板miR-499、miR-146a表達(dá)情況（±s）

注：與輕度病變亞組比較，aP＜0.05；與中度病變亞組比較，bP＜0.05

項(xiàng)目 輕度病變亞組（n=25）重度病變亞組（n=36）miR-499/β-actin1.23±0.11 1.64±0.32a2.19±0.15ab miR-146a/β-actin0.86±0.09 1.15±0.16a1.42±0.18ab中度病變亞組（n=78）

表6 Gensini評(píng)分與血小板miR-499、miR-146a表達(dá)相關(guān)性分析

圖1 Gensini評(píng)分與血小板miR-499、miR-146a表達(dá)相關(guān)性分析

目前，臨床上用于診斷冠脈病變嚴(yán)重程度的金標(biāo)準(zhǔn)是CAG，是目前為止最可靠、最準(zhǔn)確的冠脈病變?cè)\斷方法[12]。但是由于CAG檢查費(fèi)用昂貴、患者需提前預(yù)約，且屬于有創(chuàng)性檢查，風(fēng)險(xiǎn)較高，很多患者不愿意接受CAG檢查，導(dǎo)致臨床推廣受限，從而影響ACS患者早期冠脈病變程度的判斷和后續(xù)治療方案的選擇。目前臨床上還會(huì)采用其他一些生化指標(biāo)，包括cTnI、BNP、CRP等作為診斷手段[13]，但只作為冠脈發(fā)生病變的輔助檢查手段，判斷冠脈病變程度的敏感性和特異性較低。

miRNAs是真核生物基因中一類非編碼的負(fù)性調(diào)控RNA，可以通過與靶基因3’-非編碼區(qū)結(jié)合抑制RNA轉(zhuǎn)錄[14]。目前，關(guān)于miRNAs與腫瘤和心腦血管疾病之間的關(guān)系研究已經(jīng)成為全球醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)。國(guó)外有學(xué)者通過生物信息學(xué)和基因芯片技術(shù)，初選ACS患者與健康人群具有表達(dá)差異性的miRNA譜，包括miR-499、miR-146a等多種基因呈高表達(dá)，從而證實(shí)大量miRNAs參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、血小板活化、易損斑塊破裂等過程。但是由于基因芯片技術(shù)雖然簡(jiǎn)單易行，篩選信息量大，但是敏感度較低，而且成本昂貴，qRT-PCR是目前實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)科最常使用的可靠的檢測(cè)方式，因此筆者希望通過本項(xiàng)研究探討采用qRT-PCR檢測(cè)血小板miR-499和miR-146a作為冠脈病變程度診斷標(biāo)志物的可行性。結(jié)果顯示，ACS患者血小板miR-499和miR-146a表達(dá)水平明顯高于非CHD受試者，且患者冠脈病變程度越高，血小板miR-499和miR-146a表達(dá)水平越高。提示miR-499和miR-146a與ACS的發(fā)生密切相關(guān)，且隨著病情加重而表達(dá)上調(diào)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ACS患者Gensini評(píng)分與血小板miR-499、miR-146a表達(dá)呈正相關(guān)性，說明血小板miR-499、miR-146a表達(dá)水平與冠脈病變嚴(yán)重程度之間有一定的影響。

綜上所述，我們首次探討血小板miR-499、miR-146a表達(dá)水平與ACS的發(fā)生以及冠脈病變程度的相關(guān)性，可作為ACS診斷和預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度的潛在分子標(biāo)志物，同時(shí)也為ACS的個(gè)體化基因治療提供潛在的靶點(diǎn)和方向。