液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于分析化學(xué)實驗教學(xué)的探索

王 瑩， 丁 越， 王新宏， 張 彤

(上海中醫(yī)藥大學(xué) a. 中藥學(xué)院; b. 教學(xué)實驗中心， 上海 201203)

0 引 言

分析化學(xué)是發(fā)展和和應(yīng)用各種理論、方法、儀器和策略以獲得有關(guān)物質(zhì)在空間和時間方面組成和性質(zhì)信息的一門科學(xué)，是最早發(fā)展起來的化學(xué)分支學(xué)科，其在科學(xué)體系中的重要作用不言而喻。分析化學(xué)是高等學(xué)校化學(xué)化工、生物學(xué)、材料學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)等專業(yè)的主干基礎(chǔ)課程之一。分析化學(xué)課程體系中既有嚴(yán)密而系統(tǒng)的理論，還有很強(qiáng)的實用性，是理論與實際密切結(jié)合的學(xué)科。通過本課程的學(xué)習(xí)，學(xué)生不僅需要掌握分析化學(xué)的基本理論，更需要掌握不斷發(fā)展和更新的實驗方法。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)集色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高專屬性于一體，是當(dāng)今分析化學(xué)中最重要的定性和定量分析技術(shù)之一[1]。液質(zhì)聯(lián)用中色譜技術(shù)的優(yōu)勢在于對待分析的混合物進(jìn)行有效的分離，但色譜方法有時無法實現(xiàn)定性和定量的檢測功能，比如常規(guī)的紫外檢測器對無紫外吸收的化合物的檢測以及未知化合物的定性都無能為力。質(zhì)譜法能提供豐富的分子量信息，并能夠同時監(jiān)測化合物的母離子和子離子進(jìn)行定量分析，因此具有較高專屬性和靈敏度。質(zhì)譜法與色譜方法聯(lián)用，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2-5]。根據(jù)學(xué)校實驗教學(xué)要求，將前期成熟的科研成果應(yīng)用于實驗教學(xué)中，形成“液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對中藥黃芩中黃芩苷和黃芩素的定性和定量分析”實驗課程教學(xué)內(nèi)容，在實驗教學(xué)中取得了良好的效果。

1 實驗原理

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩在抗炎、抗氧化、抗缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)免疫、保肝以及抗腫瘤等多方面具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值[6-8]。黃酮類化合物是黃芩的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。其中，黃芩苷和黃芩素含量較高，活性明確，是評價黃芩質(zhì)量優(yōu)劣的主要指標(biāo)[9]。黃芩苷和黃芩素的分子式分別為C21H18O11、C15H10O5，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

黃芩苷Baicalin; mol.wt. 446

黃芩素Baicalein; mol. wt.270

本實驗利用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，采用葛根素作為內(nèi)標(biāo)，對黃芩藥材中黃芩苷、黃芩素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。該方法與紫外分光光度法[10]和高效液相色譜法[11-13]相比，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速等特點。

2 實驗材料和儀器

2.1 儀器

Agilent l290液相色譜系統(tǒng)(包括G4220A型二元輸液泵，G4226A型自動進(jìn)樣器，Gl316C型柱溫箱)，Agilent 6460 Triple Quad LC/MS 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源(ESI源)，美國Agilent公司；梅特勒XS105DU 分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)；SB3200 超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司)；0.45 μm濾膜過濾器、微量注射器。

2.2 材料與試劑

黃芩藥材，批號：130401，購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?；黃芩苷對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：110715-201016，供含量測定用；黃芩素對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：111595-200904，供含量測定用；葛根素對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：0752-9605，供含量測定用；甲醇、乙腈(色譜純，Merk)，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

(1) 色譜條件。色譜柱：Eclipse XDB C18(50 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)，C18保護(hù)柱(10 mm × 2.1 mm × 3.5 μm)；流動相：溶劑A：水(0.1%甲酸水溶液)，溶劑B：甲醇(0.1%甲酸甲醇溶液)；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。流動相梯度洗脫比例見表1。

表1 HPLC-MS/MS流動相梯度洗脫條件

(2) 質(zhì)譜條件。 離子源：電噴霧離子化源(ESI)；離子源噴射電壓：+4 kV；干燥氣(N2)流速：10 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；霧化氣(N2)壓力：275.8 kPa(40 psi)；質(zhì)譜檢測器選擇性監(jiān)測條件見表2，黃芩苷、黃芩素和葛根素色譜圖見圖1～3。

3.2 試樣制備

(1) 對照品貯備液。分別稱取黃芩苷、黃芩素對

表2 HPLC-MS-MS質(zhì)譜檢測器監(jiān)測參數(shù)

圖1 黃芩苷對照品HPLC-MS/MS色譜圖

圖2 黃芩素對照品HPLC-MS/MS色譜圖

圖3 葛根素對照品HPLC-MS/MS色譜圖

照品約5 mg，精密稱量，置25 mL容量瓶中，采用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，黃芩苷、黃芩素對照品貯備液濃度分別為187 μg/mL、25.2 μg/mL。

(2) 內(nèi)標(biāo)溶液。稱取葛根素對照品約5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶，甲醇溶解并稀釋至刻度，準(zhǔn)確吸取上述葛根素溶液適量，50 %甲醇水溶液稀釋制成濃度為10 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液。

(3) 對照品溶液的配制。準(zhǔn)確吸取黃芩苷、黃芩素對照品貯備液適量，加50%甲醇水溶液稀釋成系列濃度對照品溶液，其中黃芩苷濃度分別為:46.75，23.38，11.69，5.85，2.925，1.462 5 μg/mL；黃芩素濃度分別為：6.3，3.15，1.575，0.787 5，0.393 8，0.196 9 μg/mL。

(4) 供試品溶液的制備。 黃芩藥材50 g粉碎，取約0.1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加50 %甲醇適量，超聲處理30 min，放置，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，以50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾。

3.3 進(jìn)樣分析

分別精密移取系列對照品溶液和供試品溶液各0.4 mL，加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，50 %甲醇水溶液稀釋至10 mL。各進(jìn)樣2 μL，記錄總離子流色譜圖、黃芩苷、黃芩素及葛根素質(zhì)譜圖和色譜圖。供試品溶液重復(fù)測定3次。

4 結(jié)果與分析

4.1 定性分析

黃芩苷(相對分子質(zhì)量446.35)在正離子檢測方式下的[M+H]+峰為準(zhǔn)分子離子峰，m/z為447.1；二級質(zhì)譜特征離子的m/z為271.0，由準(zhǔn)分子離子m/z447.2的[M+H]+失去一分子的葡萄糖醛酸產(chǎn)生，與對照品的質(zhì)譜圖和色譜保留行為對照可確認(rèn)為黃芩苷。同法確認(rèn)黃芩素準(zhǔn)分子離子m/z271.2及二級質(zhì)譜離子m/z123.3，葛根素(內(nèi)標(biāo))分別為m/z417.0及m/z296.9。

4.2 定量分析

(1) 分別以黃芩苷、黃芩素與內(nèi)標(biāo)峰面積比值和對照品濃度作線性回歸，并計算回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(見表3)。

表3 黃芩苷與黃芩素線性關(guān)系考察

結(jié)果表明：黃芩苷濃度在0.058 5～1.87 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為:Y=0.004 493X-0.098 62，γ=0.995 6；黃芩素濃度在0.007 88～0.252 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為:Y=0.000 899 6X+0.005 768，γ=0.999 6。

(2) 分別將黃芩苷、黃芩素與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的峰面積值代入回歸方程，計算黃芩藥材中黃芩苷和黃芩素的含量(見表4)。

表4 黃芩藥材中黃芩苷和黃芩素含量測定結(jié)果

結(jié)論：黃芩藥材中黃芩苷的含量為15.81%，黃芩素的含量為1.99%。

5 結(jié) 語

近年來，隨著素質(zhì)教育的提出，各高校越來越注重培養(yǎng)學(xué)生的實際動手能力。大型儀器設(shè)備是高等學(xué)校從事教學(xué)、科研的重要條件和基本手段，利用大型儀器設(shè)備指導(dǎo)學(xué)生科研不僅可以提高大型儀器設(shè)備的使用效率，同時對提高學(xué)生的科研能力也有益處[14-15]。我校分析化學(xué)實驗教學(xué)改革中，在利用大型儀器設(shè)備進(jìn)行實驗教學(xué)活動中，取得了一定的經(jīng)驗。在中藥學(xué)、藥學(xué)等專業(yè)本科生的實驗教學(xué)中，引入高效液相色譜、氣相色譜、紅外光譜、原子吸收光譜和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等大型實驗儀器，并將科研成果引入實驗教學(xué)中，通過大型儀器實驗教學(xué)，能夠更好地激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情、培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識并鍛煉學(xué)生動手實踐的能力，可以為學(xué)生今后從事科研工作奠定良好基礎(chǔ)。

本實驗項目是在前期科研課題研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)分析化學(xué)課程實驗教學(xué)任務(wù)和課時的安排，進(jìn)行的實驗內(nèi)容的設(shè)置。一般分析化學(xué)中含量測定方法學(xué)考察內(nèi)容包括：線性關(guān)系實驗、精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、重復(fù)性實驗和加樣回收實驗等，課題組在前期完成黃芩藥材中黃芩苷和黃芩素的含量測定方法研究中，進(jìn)行了完整的方法學(xué)研究，表明本法穩(wěn)定、可靠。本實驗因課時限制，在完成教學(xué)任務(wù)，保證教學(xué)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，故只選擇了方法學(xué)考察中線性關(guān)系作為實驗內(nèi)容。