基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討葛根治療高脂蛋白血癥的潛在作用靶點(diǎn)

治丁銘，隋殿軍，豈 蕊，苗永迪，韓 冬，婁石磊，邱 悅，孫 聰

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸基礎(chǔ)教研室，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與中藥藥理教研室，吉林 長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，吉林 長春 130117)

葛根(pueraria)是豆科植物野葛或粉葛的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，產(chǎn)地主要分布在吉林、遼寧、河北和河南等地，屬于吉林省道地藥材。葛根性涼，味甘、辛，具有解表退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功效[1]。葛根中主要活性物質(zhì)是異黃酮，如葛根素、3-羥基葛根素、3-甲氧基葛根素和葛根素-木糖苷等，其次是大豆苷、大豆苷元和花生素等，其中葛根素占主體[2]，還含有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖和鐵、鈣、銅、硒等礦物質(zhì)[3]，是名貴滋補(bǔ)品，有“千年人參”之美譽(yù)。葛根素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗心律失常、抗心肌缺血、抗脂質(zhì)過氧化、抗血小板聚集和降血壓等心血管藥理作用，主要用于心腦血管疾病的治療[4]；還具有降血糖、降血脂、抗氧自由基和解痙等功能，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。

隨著基因、蛋白和代謝組學(xué)的發(fā)展，許多學(xué)者嘗試用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)解釋中藥的作用機(jī)制。但由于中藥多成分、多途徑和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，很難明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)?；跀?shù)據(jù)庫的共享和系統(tǒng)生物學(xué)的理論，Hopkins[5]提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)概念和研究方法，通過搜集數(shù)據(jù)庫的信息，構(gòu)建系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測多分子協(xié)同作用機(jī)制。陶靈佳等[6]從TCM-PTD獲取健脾補(bǔ)腎復(fù)方中藥的分子、靶標(biāo)，建立中藥分子-靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出378個(gè)中藥分子和63個(gè)大腸癌靶標(biāo)，其相互作用共125組。李剛等[7]通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲆蜣?，篩選出221個(gè)關(guān)鍵基因及淫羊藿治療骨質(zhì)疏松癥Wnt、TGF-β和Notch等信號通路。本文作者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，預(yù)測葛根抗高脂蛋白血癥(hyperlipoproteinemia)的活性成分和潛在作用靶點(diǎn)，探討其抗高脂蛋白血癥的作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 葛根潛在作用靶標(biāo)的預(yù)測

1.1.1 葛根小分子化合物信息 采用臺灣中醫(yī)藥資料庫[8](TCM Database@Taiwan)、PubMed、SinoMed和化學(xué)數(shù)據(jù)庫等收集葛根的化學(xué)成分，得到22個(gè)已知化學(xué)成分信息。

1.1.2 葛根相似藥物和潛在作用靶標(biāo) 采用Drugbank數(shù)據(jù)庫預(yù)測葛根中化學(xué)成分的相似藥物。Drugbank數(shù)據(jù)庫中包括詳細(xì)的藥物數(shù)據(jù)(如化學(xué)數(shù)據(jù)、藥理數(shù)據(jù)、藥物數(shù)據(jù))和綜合的藥物靶點(diǎn)信息(如序列、結(jié)構(gòu)和作用途徑)[9]?；诮Y(jié)構(gòu)相似性原理，利用Drugbank中的similarity工具，獲得與葛根所含化學(xué)成分具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的已知藥物分子(結(jié)構(gòu)相似度標(biāo)準(zhǔn)：similar score≥0.7)，并將已知相似藥物做為葛根藥物的候選靶標(biāo)分子通過Mechanism afaction尋找其作用靶標(biāo)。

1.2 高脂蛋白血癥相關(guān)基因

基于TTD(Therapeutic Target Database)、DrugBank、GAD(Genetic Association Database)和OMIM數(shù)據(jù)庫[10-11]，以“hyperlipoproteinemia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取、篩選整理與高脂蛋白血癥相關(guān)的蛋白。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、化合物與蛋白質(zhì)之間互作關(guān)系信息，采用HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、STITCH、DIP、PDZBase、BIND和STRING數(shù)據(jù)庫，檢索選擇置信度高的分子(置信度標(biāo)準(zhǔn)：confidence≥0.7，high confidence)進(jìn)行整合建立互作網(wǎng)絡(luò)。采用Cystoscape 3.6.0軟件[12]進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析和可視化工作，“節(jié)點(diǎn)”代表分子如化合物、蛋白質(zhì)和疾病，“邊”代表分子間相互作用關(guān)系如葛根活性成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病、葛根活性成分、靶點(diǎn)與疾病的交互。通過評價(jià)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特性來分析，構(gòu)建葛根活性成分-靶標(biāo)-疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過分析葛根活性成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病之間的復(fù)雜關(guān)系，預(yù)測藥物治療高脂蛋白血癥潛在的靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 葛根潛在作用靶標(biāo)

獲得51個(gè)與葛根中9種化學(xué)成分具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的已知藥物分子，見表1。刪除重復(fù)者后得到葛根中7種化學(xué)成分可能的60個(gè)蛋白靶標(biāo)(其中2種成分Formononetin和Genistein-8-c-glucoside的相似藥物未找到靶標(biāo)蛋白)。見表2。

表1 與葛根化學(xué)成分相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物分子

表2 葛根化學(xué)成分作用靶點(diǎn)

2.2 靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

將各數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果進(jìn)行篩選整理，獲得與高脂蛋白血癥疾病相關(guān)的28個(gè)蛋白，包括載脂蛋白E(APOE)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)、載脂蛋白AⅠ(APOAⅠ)、載脂蛋白AⅡ(APOAⅡ)、載脂蛋白AⅤ(APOAⅤ)、載脂蛋白B(APOB)、載脂蛋白CⅠ(APOCⅠ)、載脂蛋白CⅡ(APOCⅡ)、雄激素受體(AR)、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶2(CPT2)、細(xì)胞色素P450(CYP450)、胞漿環(huán)氧化物水解酶抗體(EPHX2)、科凱恩綜合征相關(guān)蛋白/早衰蛋白CSA抗體(ERCC8)、凝血因子Ⅺ(FACTOR Ⅺ)、纖維蛋白原A(FGA)、生長激素受體(GHR)、糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白結(jié)合蛋白1(GPIHBP1)、G底物(GSBS)、中間α-球蛋白抑制因子H4(ITIH4)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、谷胱甘肽磷酸膽固醇-高密度脂蛋白結(jié)合蛋白1(LIPI)、脂肪酶成熟因子1(LMF1)、核纖層蛋白(LMNA)、溶血磷脂酸(LPA)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARA)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)和RP1基因(RP1)。

通過軟件String 10.0和Cytoscape 3.6.0，用預(yù)測得到的藥物成分對應(yīng)的60個(gè)靶點(diǎn)蛋白和28個(gè)疾病相關(guān)蛋白構(gòu)建“靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示：此網(wǎng)絡(luò)包括54個(gè)節(jié)點(diǎn)和157條邊，其中54個(gè)節(jié)點(diǎn)包括22個(gè)疾病蛋白和32個(gè)靶點(diǎn)(其中包括3個(gè)共有成分)，每條邊表示疾病蛋白和靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，平均節(jié)點(diǎn)的degree值為4.76，聚集系數(shù)為0.451。Degree值超過平均值的靶標(biāo)蛋白：Src、NF-κB、PPARs、雌激素受體α(Esr1)、AHR、APOAⅠ、APOAⅡ、APOAⅤ、APOB、APOCⅠ、APOCⅡ、APOE、LDLR、LPL、ABCA1、LPA、GPIHBP1和FGA，Cyp158A2和AR既是疾病相關(guān)蛋白又是藥物活性成分的靶點(diǎn)。預(yù)測這些蛋白可能是葛根治療高脂蛋白血癥的潛在靶點(diǎn)。

2.3 葛根活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

將葛根活性成分-靶點(diǎn)的對應(yīng)關(guān)系輸入到Cytoscape3.6.0軟件，得到的網(wǎng)絡(luò)與疾病蛋白-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖合并，直觀得到葛根中活性成分治療高脂蛋白血癥的潛在靶點(diǎn)，見圖2(插頁一)。圖中長方形代表葛根中的7個(gè)化學(xué)成分，三角形代表疾病的蛋白，橢圓形代表葛根化學(xué)成分的靶點(diǎn)。

2.4 KEGG通路富集分析

通過String10.0軟件，對靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)中涉及的蛋白在信號通路中的作用進(jìn)行KEGG pathway富集分析，得到12條信號通路，根據(jù)P<0.01篩選出8條，其中KEGG pathway通過查看基因在通路中的分布情況，可以了解該基因在代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中的作用。見表3。

表3 與高脂蛋白血癥相關(guān)的葛根潛在靶點(diǎn)富集的通路

3 討 論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出葛根治療高脂蛋白血癥的7種活性成分。通過活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)特征分析，得到20個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。PPAR可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥發(fā)揮作用。Esr1具有抗炎、促血管損傷修復(fù)、增加冠狀血流量的作用。NF-κB參與急慢性炎癥反應(yīng)。CYP450是可自身氧化的亞鐵血紅素蛋白家族，屬于單氧酶；哺乳動(dòng)物的CYP450是膜的組分，參與生物合成和許多生理活性物質(zhì)的代謝。AR是核受體超家族中的類固醇受體，影響脂肪細(xì)胞分化、促進(jìn)脂解作用和抑制脂質(zhì)合成，減少脂肪在脂肪組織中的沉積，改善肝臟代謝，對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。APOAⅠ在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制LDL的氧化修飾、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用。APOAⅡ與APOAⅠ一樣，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。APOAⅤ是甘油三酯代謝的關(guān)鍵酶LPL的激活劑，促進(jìn)甘油三酯分解。APOB介導(dǎo)LDL與相應(yīng)受體結(jié)合，調(diào)節(jié)LDL從血漿中清除。APOCⅠ抑制LPL活性，通過改變APOE結(jié)構(gòu)使富含甘油三酯的脂蛋白延時(shí)清除。APOCⅡ激活LPL活性，也會通過改變LPL的空間結(jié)構(gòu)激活LPL，催化水解甘油三酯。LPL是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，通過水解血漿中富含甘油三酯的脂蛋白為機(jī)體組織提供游離脂肪酸氧化供能。LPA是細(xì)胞膜脂類衍生物，有可能作為分子標(biāo)記物，反映血小板等細(xì)胞的活化狀態(tài)，預(yù)警血栓形成的危險(xiǎn)性。GPIHBP1在富含甘油三酯脂解過程中發(fā)揮重要作用，協(xié)助LPL轉(zhuǎn)運(yùn)。ABCA1是細(xì)胞膜上重要的膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白，將細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，再經(jīng)HDL運(yùn)送到肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁酸完成膽固醇代謝。FGA既是炎癥標(biāo)志物又是凝血因子，F(xiàn)GA水平增高是動(dòng)脈硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

圖1 高脂蛋白血癥相關(guān)蛋白-葛根化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

Fig.1 Network of hyperlipoproteinemia-related proteins-potential targets of chemical constiuents of pueraria

綜合分析顯示：葛根中的黃豆苷、葛根素通過EP300與PPARs發(fā)生相互作用，PPARs在人和嚙齒類動(dòng)物中包含PPARα、β和γ 3種亞型，PPARα主要在肝臟表達(dá)，可調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，參與脂代謝所有過程如脂肪酸攝取、結(jié)合與氧化，脂蛋白組合、運(yùn)輸與代謝的基因，是脂代謝關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)過氧化物酶體和線粒體的脂肪酸β-氧化，加速脂肪酸的分解，促進(jìn)膽汁酸的生成，對清除血中的膽固醇起著重要作用。體內(nèi)合成的膽固醇和從血漿脂蛋白中吸收的膽固醇均需轉(zhuǎn)化成膽汁酸或以游離膽固醇形式經(jīng)肝膽管排出，CYP7A1是膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的限速酶[13-14]，在膽固醇的代謝中起重要作用，CYP7A1表達(dá)依賴PPARα。而CYP7A1是CYP450家族中的成員，除了在骨骼肌和成熟的紅細(xì)胞外所有的組織和器官均表達(dá)。研究[15-16]顯示：PPARα激活劑GW7845和PPARγ配體WY14643、羅格列酮可提高巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA水平，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。PPARγ影響GPIHBP1的表達(dá)，在GPIHBP1的調(diào)控序列上發(fā)現(xiàn)許多PPARs的結(jié)合位點(diǎn)，其中5個(gè)是結(jié)合PPARγ的。GPIHBP1通過與乳糜微粒上帶有正電荷的載脂蛋白A5、E、B48結(jié)合，同時(shí)與LPL結(jié)合發(fā)揮脂解平臺的作用。

葛根中花生四烯酸(arachidonic acid)是生物體內(nèi)含量豐富、分布廣泛的多不飽和脂肪酸，可經(jīng)CYP450氧化酶途徑代謝為環(huán)氧化二十碳三烯酸(EETs)，降解為活性較弱的二羥基-20碳三烯酸[17]。CYP450-EETs系統(tǒng)在調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝方面發(fā)揮重要作用，過表達(dá)可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠皮下及內(nèi)臟脂肪的積聚，減輕肥胖小鼠體質(zhì)量，改善高脂誘導(dǎo)的血管功能異常[18]；可通過抑制脂毒性相關(guān)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激從而減輕高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟脂肪變性[19]。研究[15]顯示：CYP和EETs均是PPARα的配體激動(dòng)劑。葛根中的甾醇類藥物是γ-谷甾醇，預(yù)測發(fā)現(xiàn)其相似藥物的靶標(biāo)分子是通過AR和Esr1發(fā)揮作用的，睪酮有改善脂質(zhì)代謝的作用，雌激素能提高肝臟中ABCA1的表達(dá)水平。Nettleship等[20]觀察睪酮及AR功能缺失的睪丸雌性化的小鼠發(fā)現(xiàn)：睪酮水平與HDL呈正相關(guān)關(guān)系；Haffner等[21]的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：睪酮與脂質(zhì)代謝有關(guān)，睪酮水平與總膽固醇、LDL及甘油三酯呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Malkin等[22]對性功能減退男性采用睪酮替代治療可改善血脂代謝，降低總膽固醇，降低炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素1和6(IL-1和IL-6)的表達(dá)，提高IL-10表達(dá)；睪酮的調(diào)脂機(jī)制可能是通過激活肝臟的LPL，使游離脂肪酸向外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)其進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化分解。Esr1與雌激素結(jié)合，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的功能，影響血管的收縮和舒張；還可通過改善脂代謝，降低總膽固醇和LDL，增加HDL水平，Esr1具有抗炎、促血管損傷修復(fù)、增加冠脈血流量等多重作用[23]。

綜上所述，本文作者推測葛根的有效成分通過上述靶點(diǎn)相互作用，實(shí)現(xiàn)其降脂、抗炎和改善血管彈性等作用。本研究結(jié)果為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了科學(xué)依據(jù)。