解偶聯(lián)蛋白2過(guò)表達(dá)對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用

鄭貴浪，郭予雄，呂娟娟，黃錦達(dá)，劉 翠，曾其毅

(1.廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院兒科，廣東 廣州 510030；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510220)

膿毒癥是由感染誘發(fā)的機(jī)體調(diào)節(jié)失衡所致的危及生命的器官功能障礙[1]，其高發(fā)病率和高死亡率耗費(fèi)了大量的醫(yī)療資源。研究[2]顯示：膿毒癥時(shí)心功能障礙的發(fā)生率高達(dá)40%，且與其導(dǎo)致的線粒體功能障礙有關(guān)。解偶聯(lián)蛋白2 ( uncoupling protein 2 ，UCP2)屬于線粒體陰離子通道家族成員之一，廣泛分布于心、肺和腦等器官和組織中，在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究[3]表明：UCP2參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)、食物的攝入和多種代謝性疾病的病理生理過(guò)程。體內(nèi)外研究[3-4]顯示：UCP2上調(diào)可以通過(guò)調(diào)控膜電位進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元，而UCP2基因敲除則會(huì)導(dǎo)致線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生明顯增多以致?lián)p害神經(jīng)元。近年來(lái)研究[5]顯示：UCP2可作為臨床嚴(yán)重膿毒癥的特異性標(biāo)記物。對(duì)于心肌細(xì)胞，尤其在膿毒癥狀態(tài)下的心肌細(xì)胞中UCP2的作用，近年來(lái)報(bào)道較少。本課題組前期研究[6]顯示：通過(guò)干擾心肌中UCP2的表達(dá)，膿毒癥可使心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能明顯受損。為進(jìn)一步揭示UCP2的作用，本研究在構(gòu)建UCP2過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株心肌細(xì)胞基礎(chǔ)上，采用脂多糖/聚糖肽(LPS/PepG)刺激心肌細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)線粒體形態(tài)與功能的相關(guān)指標(biāo)，揭示UCP2在膿毒癥心肌細(xì)胞中的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 UCP2過(guò)表達(dá)H9C2心肌細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建提取大鼠總RNA，采用常規(guī)基因操作技術(shù)，將UCP2基因構(gòu)建到pMD19-T質(zhì)粒；以EcoRⅠ和NotⅠ為插入位點(diǎn)，將UCP2基因克隆到慢病毒載體(PHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro穿梭載體)，通過(guò)慢病毒包裝及滴度測(cè)定，將克隆成功的UCP2慢病毒穿梭載體感染H9C2心肌細(xì)胞，篩選出UCP2過(guò)表達(dá)H9C2細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分成4組：①正常對(duì)照組，給予等量生理鹽水刺激；② LPS/PepG 刺激組，同時(shí)給予LPS和PepG刺激；③ 空病毒組，空病毒載體(PHBLV)轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，同時(shí)給予LPS和PepG刺激；④ 過(guò)表達(dá)組，UCP2過(guò)表達(dá)H9C2細(xì)胞同時(shí)給予LPS和PepG刺激。上述LPS終濃度為2 mg·L-1，PepG終濃度為 20 mg·L-1。

1.3 RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平① RT-PCR法。UCP2引物：GGGCACCTGTGGTGCTACCTG(R)，ATGAGCTTTGCCTCCGTCCGC(F)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為118 bp；GAPDH引物：GAAGATGGTGATGGGTTTCC(R),CTACAACGACCCCTTCA-TTG(F)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為136 bp；18sRNA引物:CCATCCAATCGG TAGTAGC(R),GTAATGGCGG GTCATAAG(F)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為80 bp。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)到的SYBR Green Ⅱ的熒光信號(hào)，計(jì)算目的基因UCP2的相對(duì)表達(dá)水平，即目的基因的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。② Western blotting法。裂解液裂解H9C2細(xì)胞，離心后取上清，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度；根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量；提取總蛋白，加入SDS蛋白上樣緩沖液煮沸保存?zhèn)溆?；Western blotting 法檢測(cè)蛋白表達(dá)，采用化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行顯影。利用Kodak In-Vivo Imagine System F化學(xué)發(fā)光/活體成像分析系統(tǒng)采集圖像，Gel-Pro analyzer 4.0軟件比較各條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4 心肌細(xì)胞中肌酸激酶(CK)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平檢測(cè)采用分光光度計(jì)法檢測(cè)心肌細(xì)胞中CK水平，采用ELISA法檢測(cè)心肌細(xì)胞中TNF-α水平，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(CK測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，ELISA試劑盒購(gòu)自北京博凌科為生物科技有限公司)。CK水平升高提示心肌細(xì)胞損害，TNF-α水平升高提示炎癥信號(hào)通路啟動(dòng)。

1.5 電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)常規(guī)制備培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞的電鏡標(biāo)本，超薄切片染色后電鏡觀察H9C2細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位(MMP)水平采用一種陽(yáng)離子脂質(zhì)熒光染料JC-1作為檢測(cè)MMP指示劑。JC-1在低濃度時(shí)可發(fā)射綠色熒光，高濃度時(shí)發(fā)射光為紅色熒光。MMP升高時(shí)，JC-1聚合體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值升高；MMP下降時(shí)，JC-1單體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值降低。利用這一特性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中MMP水平，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。具體操作步驟按照細(xì)胞線粒體分離試劑盒(南京建成生物科技有限公司，貨號(hào)G003)和MMP檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)KGA604)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)心肌細(xì)胞中線粒體ROS和三磷酸腺苷(ATP)水平采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)心肌細(xì)胞中線粒體 ROS和ATP水平。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ROS檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0033)和ATP檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)A016-1)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

2 結(jié) 果

2.1 各組H9C2心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，LPS/PepG 刺激組 H9C2心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P< 0.05)；過(guò)表達(dá)組H9C2心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組、LPS/PepG 刺激組和空病毒組(P< 0.05)；與LPS/PepG 刺激組比較，空病毒組H9C2心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果提示H9C2心肌細(xì)胞UCP2過(guò)表達(dá)模型構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1和表1。

Lane 1:Normal control group;Lane 2:LPS/PePG group;Lane 3:PHBLV group;Lane 4:PHBLV-UCP2 group.

圖1 各組H9C2心肌細(xì)胞中UCP2蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of UCP2 protein in H9C2 cells in various groups

2.2 各組H9C2心肌細(xì)胞中CK和TNF-α水平 與正常對(duì)照組比較， LPS/PepG 刺激組H9C2心肌細(xì)胞中CK和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；與LPS/PepG 刺激組和空病毒組比較，過(guò)表達(dá)組H9C2細(xì)胞中CK和TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)?？詹《窘MH9C2心肌細(xì)胞中CK和TNF-α水平與LPS/PepG 刺激組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 各組H9C2心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu) 電鏡下觀察：正常對(duì)照組心肌細(xì)胞線粒體邊界清楚，基質(zhì)均勻，線粒體嵴致密，形態(tài)正常。LPS/PepG 刺激組心肌細(xì)胞線粒體邊界模糊不清，體積腫脹明顯，基質(zhì)密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解，甚至出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象，可見(jiàn)空泡樣變。與LPS/PepG 刺激組比較，過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)有所改善，表現(xiàn)為線粒體腫脹減輕，基質(zhì)密度增高，內(nèi)膜破裂及嵴斷裂減少，空泡樣變不明顯，但尚未能完全恢復(fù)到生理鹽水組的水平。空病毒組心肌細(xì)胞線粒體電鏡下結(jié)構(gòu)改變與LPS/PepG 刺激組相似。見(jiàn)圖2。

表1 各組H9C2心肌細(xì)胞中UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及CK、TNF-α水平

GroupUCP2 mRNAUCP2 proteinCK [λB/(U·L-1)]TNF-α[ρB/(ng·L-1)]Normal control 1.05±0.050.25±0.023.17±0.054.23±0.13LPS/PepG 1.43±0.02?0.35±0.01?6.45±0.07?6.69±0.09?PHBLV 1.47±0.02?0.35±0.02?6.40±0.076.73±0.13?PHBLV-UCP2 1.94±0.01?△# 0.57±0.01?△#3.43±0.04△#5.30±0.27△#F466.571.81 328.9837.3P0.000.000.000.00

*P< 0.05 compared with normal control group；△P< 0.05 compared with LPS/PepG group;#P< 0.05 compared with PHBLV group.

A：Normal control group；B： LPS/PepG group；C: PHBLV group；D: PHBLV-UCP2 group.

2.4 各組H9C2心肌細(xì)胞中MMP水平 激光共聚焦顯微鏡定性觀察：與正常對(duì)照組比較，LPS/PepG刺激組、空病毒組和過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞中紅色熒光(JC-1聚合體)/綠色熒光(JC-1單體)明顯下降；與LPS/PepG 刺激組和空病毒組比較，過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞中紅色熒光(JC-1聚合體)/綠色熒光(JC-1單體)明顯上升。陽(yáng)性對(duì)照組幾乎不見(jiàn)紅色熒光。見(jiàn)圖3(插頁(yè)一)。與正常對(duì)照組比較，LPS/PepG 刺激組和空病毒組心肌細(xì)胞中MMP水平明顯降低(P< 0.05)；過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞中MMP水平明顯高于LPS/PepG 刺激組和空病毒組(P< 0.05)，但仍然低于正常對(duì)照組(P< 0.05)；與LPS/PepG 刺激組比較，空病毒組心肌細(xì)胞MMP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.5 各組H9C2心肌細(xì)胞中線粒體ROS和ATP水平 與正常對(duì)照組比較，LPS/PepG 刺激組和空病毒組心肌細(xì)胞中線粒體ROS水平明顯升高(P<0.05)，ATP水平明顯降低(P<0.05)；與LPS/PepG 刺激組和空病毒組比較，過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞中線粒體ROS水平明顯減低(P<0.05)，ATP水平明顯升高(P<0.05)。與LPS/PepG組比較，空病毒組心肌細(xì)胞線粒體ROS和ATP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組H9C2心肌細(xì)胞中MMP和線粒體ROS及ATP水平

GroupMMPROSATP[mB/(μmol·g-1)]Normal control 0.424±0.0061.00±0.146.19±0.07LPS/PepG 0.213±0.005?2.53±0.03?2.65±0.05?PHBLV0.206±0.006?2.49±0.04?2.55±0.12?PHBLV-UCP2 0.399±0.007?△#1.73±0.06△# 4.54±0.08△#F567.8183.81 322.6P0.000.000.00

*P< 0.05 compared with normal control group；△P< 0.05 compared with LPS/PepG group；#P< 0.05 compared with PHBLV group.

3 討 論

膿毒癥是感染誘導(dǎo)機(jī)體調(diào)節(jié)失衡所致的危及生命的器官功能不全，嚴(yán)重膿毒癥是指膿毒癥并發(fā)器官功能不全或組織低灌注。Hartman等[7]回顧性研究發(fā)現(xiàn):2005年新生兒嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)病率較1995年升高了1倍。膿毒癥誘導(dǎo)的心肌功能損害(SIMD)是嚴(yán)重膿毒癥的常見(jiàn)并發(fā)癥，其機(jī)制十分復(fù)雜[8]。

膿毒癥的動(dòng)物模型比較成熟，細(xì)胞模型目前缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[9-11]。本研究采用來(lái)自金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的PepG與來(lái)自革蘭陰性菌LPS組成混合劑，刺激H9C2心肌細(xì)胞后，檢測(cè)到培養(yǎng)液中的CK及TNF-α水平明顯升高，提示膿毒癥的細(xì)胞模型構(gòu)建成功；LPS/PepG刺激H9C2心肌細(xì)胞后，CK及TNF-α水平升高，提示LPS/PepG損害了心肌細(xì)胞,同時(shí)啟動(dòng)了炎癥通路；增加UCP2在心肌細(xì)胞中的表達(dá)后，CK及TNF-α水平明顯降低，提示UCP2對(duì)膿毒癥心肌線粒體起保護(hù)作用，其具體機(jī)制可能與UCP2調(diào)節(jié)MMP有關(guān)。

心肌細(xì)胞富含線粒體，可提供大量ATP，同時(shí)也是大量產(chǎn)生ROS的場(chǎng)所。本研究顯示：UCP2過(guò)表達(dá)可以抑制心肌線粒體ROS的過(guò)多生成，這可能與MMP趨向正常狀態(tài)有關(guān)。Kizaki等[12]和Blanc等[13]通過(guò)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染UCP2 cDNA后發(fā)現(xiàn)：巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROS量減少,而血細(xì)胞中缺乏UCP2會(huì)導(dǎo)致ROS合成增多，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的惡化，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Nègre-Salvayre等[14]研究發(fā)現(xiàn)：在肝、脾及胸腺中，GDP(UCP2解偶聯(lián)特效抑制劑)可以升高膜電位并引起ROS產(chǎn)生增多。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：UCP2可以調(diào)控ROS的合成，但其具體機(jī)制目前尚不完全清楚。

線粒體ATP水平是線粒體功能的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：膿毒癥時(shí)UCP2表達(dá)被抑制，MMP破壞，O2利用障礙，導(dǎo)致ATP合成明顯減少。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)UCP2過(guò)表達(dá)后，線粒體ATP水平明顯回升，趨近正常水平，提示UCP2對(duì)于維持線粒體ATP水平有益。可能與UCP2通過(guò)解偶聯(lián)作用減少ROS合成有關(guān)。但UCP2與線粒體ATP合成之間的關(guān)系，目前爭(zhēng)論較多[15-16]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不盡相同[17]，其機(jī)制可能與線粒體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示：LPS/PepG混合劑可導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為線粒體的邊界模糊不清，體積明顯腫脹，基質(zhì)密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解，甚至出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象，可見(jiàn)空泡樣變。Welty-Wolf等[18]在狒狒膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)：注入大腸埃希菌后12 h，狒狒的骨骼肌線粒體就出現(xiàn)線粒體嵴模糊，基質(zhì)空泡化和內(nèi)膜斷裂，提示膿毒癥導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的改變。Vanhorebeek等[19]在探討胰島素對(duì)膿毒癥患者線粒體的保護(hù)中發(fā)現(xiàn)：死于膿毒癥的20例ICU患者肝臟和肌肉組織的線粒體均明顯的腫脹、基質(zhì)密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂，并且線粒體結(jié)構(gòu)的損害與呼吸鏈復(fù)合體功能有關(guān)聯(lián)。此外，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[20]和膿毒癥患者[21]心肌細(xì)胞中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)。本研究通過(guò)慢病毒促使UCP2過(guò)表達(dá)后，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善，其機(jī)制可能與ROS及MMP有關(guān)。

UCPs可降低線粒體外膜的質(zhì)子勢(shì)能，從而穩(wěn)定MMP。UCP2可以通過(guò)解耦聯(lián)作用，開(kāi)放離子通道，H+不通過(guò)ATP合成酶直接從線粒體內(nèi)膜滲漏到線粒體基質(zhì)中，從而起到調(diào)控膜電位的作用，同時(shí)不合成ATP。本研究結(jié)果顯示： 膿毒癥導(dǎo)致心肌細(xì)胞MMP明顯下降，與本課題組前期研究結(jié)果一致[6]；UCP2過(guò)表達(dá)后，MMP接近正常水平，表明UCP2可促進(jìn)膿毒癥導(dǎo)致的MMP破壞的恢復(fù)，與傳統(tǒng)的UCP2解偶聯(lián)作用不一致，其中準(zhǔn)確機(jī)制尚不明確。綜合前期研究及其他學(xué)者[22-23]的研究結(jié)果，本文作者認(rèn)為：UCP2通過(guò)解偶聯(lián)作用調(diào)控MMP。此外，線粒體的形態(tài)結(jié)果和MMP也可能與線粒體內(nèi)鈣濃度及線粒體通透性膜轉(zhuǎn)換孔的狀態(tài)[24]等有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)未對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，UCP2過(guò)表達(dá)可以抑制膿毒癥所導(dǎo)致的大鼠心肌細(xì)胞的損害及炎癥因子的釋放，同時(shí)膿毒癥所致的線粒體形態(tài)及功能的損害，可被UCP2過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)或減輕。UCP2過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用機(jī)制可能是UCP2通過(guò)解偶聯(lián)作用調(diào)控心肌細(xì)胞MMP，減少ROS過(guò)多生成，維持線粒體的ATP合成，從而起到保護(hù)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的作用。